Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как, как положительно умерить активность гена, воспользовавшись mRNAs, которые присутствуют в клетках и тканях. Как компенсировать недостатки в активности, и как добиться высокого перевода из mRNAs in vitro и in vivo. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем глобально экран SINEUP целевых генов в живых клетках, путем изображения без фиксации и сбора.
Таким образом, последствия этого метода распространяются на нашу терапию гаплоинсуффизуемых экземпляров, потому что SINEUPs может вызвать двукратный рост дефицита белка, таких как фратаксин в случаях атаксии Фридриха. Для начала откройте браузер Зенбу и нажмите на базу данных проекта Fantom, представляющих интерес. Поиск целевого гена, и проверить для транскрипции начала сайта, или TSS, и уровень экспрессии в желаемых клеток и тканей.
Чтобы определить TSS, проконсультируйтесь с примером анализа белка болезни Паркинсона семь, или PARK7 мРНК. Проверьте TSS по области пика клетки. Чтобы определить уровни экспрессии клеток и тканей, выберите область пика клетки и нажмите на увеличение геномной области для выбора.
Проверьте выражение PARK7 в типе интереса клеток и тканей, исследуя список выражений стенограммы в нижней части страницы. Затем, дизайн связывания домена последовательности нескольких различных длин, соответствующих 40 баз вверх по течению, и 32 баз вниз по течению от первого methionine или AUG. До трансфекции с SINEUPs, семенные клетки, представляющие интерес на двух поли-д-лизин покрытием 24 пластины хорошо, как описано в рукописи.
Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор CO2 для достижения 70 процентов слияния. Очень важно распределять клетки поровну в колодцах, для этого аккуратно встряхните пластину 10 раз вперед и назад после посева клеток внутри чистой скамейки, и повторите в пятипроцентной инкубаторе CO2. После инкубации измените средний до 0,4 мл свежей среды.
Для анализа SINEUP-GFP сделайте несколько трубок 1,5 мл с 0,1 мл смешанного раствора, с pEGFP-C2, SINEUP-GFP, реагентами трансфекции и OptiMEM в каждой трубке, а затем инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавьте 0,1 мл этого смешанного раствора из каждой трубки в отдельную скважину из 24 колодцев и обозначить эти скважины SINEUP-GFP одним, двумя, тремя, четырьмя и пятью. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор CO2 в течение 24 часов.
Через 24 часа, мыть клетки с 0,5 мл PBS. Добавить 25uL 0,05 процента веса на объем трипсина, и инкубировать в пять процентов CO2 инкубатор в течение пяти минут. Добавьте 275uL клеточной среды на колодец.
Для извлечения белка возьмите одну из двух пластин и собери 225uL или три четверти клеток из одной колодец, и 75uL или одну четверть клеток для извлечения РНК, каждая в отдельную трубку 1,5 мл. Центрифуга при 6000xg в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации тщательно удалите супернатант из трубки, помеченной белковой изоляцией.
Добавьте 60uL раствора лиза к клеткам и перемешайте путем pipetting Смешивание тщательно путем вращать на медленной скорости на один час на 4 градусах Celsius. Центрифуга трубки при 14 000xg в течение 10 минут при четырех градусах цельсия для сбора белка супернатанта. Для определения концентрации белка сначала приготовьте пять-шесть разбавление свежей сыворотки крупного рогатого скота в стандарте белка альбумин в ультра-чистой воде, с концентрациями от 0,2 до 1,5 мг/мл белка.
Для приготовления рабочего реагента смесь Dash добавляет 20uL реагента S в один мл реагента А в двух мл трубки. Добавьте пять uL воды в качестве отрицательного контроля. А потом, BSA стандартный или образец белка в каждой хорошо.
Добавить 25uL реагента тире, а затем осторожно добавить 200uL реагента B на хорошо, избегая образования пузырьков. Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы инкубировать при комнатной температуре, в течение пяти-восьми минут. Измерьте абсорбанс протеина на 750nm с спектрофотометром.
Подготовь стандартную кривую, нацавав стандартные концентрации белка BSA на х-оси и их соответствующее поглощение на оси y. Применить стандартное уравнение кривой для расчета концентрации белка образца. Чтобы начать разделение белка, добавьте один том 2x погрузочного красителя к каждому объему образца белка.
Нагрейте при температуре 90 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и сразу же остыть на льду в течение одной минуты. Загрузите от 10 до 20 г образцов белка до 10 процентов полиакриламинидного геля SDS и разделите на 100-150V. Перенесите белок из геля в 0,5-метровую нитроцеллюлозную мембрану с помощью полусухого трансферного инструмента.
Заполните буфер передачи при 25V в течение 30 минут. После переноса поместите мембрану в контейнер и добавьте блокирующий раствор до тех пор, пока мембрана не будет полностью пропитана, и инкубировать ее при комнатной температуре в течение 30 минут при встряхивании. Добавьте соответствующее антитело к блокирующий раствор, и залить мембрану.
Гибридизировать путем инкубации мембраны в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тряска. После гибридизации промойте мембрану, добавив буфер 1x TBST в течение пяти минут при комнатной температуре, и повторите еще два раза. Выполните следующую гибридизацию со вторичным антителом, разбавленным блокирующим раствором над мембраной, при комнатной температуре в течение 30 минут при встряхивании.
Затем промойте мембрану, добавив буфер 1x TBST в течение пяти минут при комнатной температуре, и повторите еще два раза. Перенесите мембрану в коробку, наполненную двумя мл расширенной реагентной смеси ECL HRP. Накройте коробку алюминиевой фольгой и инкубировать в течение одной-двух минут при комнатной температуре.
Тщательно удалите мембрану из смеси реагентов ECL и подвергайте ее использованию инструмента для визуализации люминесценции. Для анализа влияния SINEUP-GFP в клетках с помощью изображений, мыть pEGFP-C2, и SINEUP-GFP трансектируемых клеток из второй пластины 24 хорошо с 0,5 мл PBS на колодец. Чтобы испачкать ядро, добавьте 2 г гехста-33342 к каждому колодец и инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Используйте цитометр изображения с высокой пропускной способностью для измерения окрашенных клеток Hoechst, чтобы подсчитать общее количество клеток. Измерьте интенсивность зеленой флуоресценции, чтобы подсчитать количество положительных клеток GFP. Для анализа, белкового upregulatory эффект SINEUPs, использовать программное обеспечение для визуализации для определения GFP интегрированной интенсивности Вычислить его как сумму всех пикселей интенсивности отображения сигналов в сегментированных объектов, полученных для каждого канала.
После успешной трансфекции с SINEUP-GFP, синтетическим SINEUP, содержащим как оптимальный обязательный домен, так и домен эффектора GFP, перевод мРНК был регулируется без изменения выражения GFP mRNA. Протокол полуавтоматического анализа изображений улучшил время обнаружения и увеличил количество образцов, одновременно скринингированных по сравнению с обычным западным анализом помарки. Несмотря на разницу в интенсивности сигнала, от 2,6 раза в анализе западной помарки до 1,4 раза в анализе изображений, были обнаружены значительно более высокие уровни флуоресценции GFP по сравнению с контролем.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы определить правильную последовательность целевых mRNAs для разработки правильного связывания домена. Гены часто транскрибируются от промоутеров, и могут использовать различные сайты инициации перевода. Браузер Зенбу является очень полезным инструментом для изучения такой дисперсии mRNA.
Мы также предлагаем разработать различные SINEUPs с переменными связывающими сайтами. В целом мы считаем, что быстрое адаптация SINEUPs к множественности целей создаст новую область, состоящую из положительно регулируемого перевода существующих РНК, что является взаимным и бесплатным для области siRNA. Часть этих функций мы предусматриваем, что эта технология будет иметь важное значение для производства большего количества белков в пробирке, как биореакторы, а также in vivo естественно исправить дозировку гена.
