Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, telles que la façon de modérer positivement l’activité d’un gène, en profitant des ARNR présents dans les cellules et les tissus. Comment compenser les carences en activité, et comment obtenir une traduction élevée à partir de mRNA in vitro et in vivo. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons globalement filtrer les gènes cibles de SINEUP dans les cellules vivantes, par imagerie sans fixation et collecte.
Ainsi, les implications de cette technique s’étendent à notre thérapie des cas haploinsufficient, parce que sineups peut induire une double augmentation d’une protéine déficiente, comme la frataxine dans les cas d’ataxie de Friedrich. Pour commencer, ouvrez le navigateur Zenbu et cliquez sur la base de données d’intérêt du projet Fantom. Recherchez le gène cible, et vérifiez le site de démarrage de transcription, ou TSS, et le niveau d’expression dans les cellules et les tissus désirés.
Pour déterminer le TSS, consultez l’exemple de l’analyse de la protéine sept de la maladie de Parkinson, ou ARNm PARK7. Vérifiez TSS par région de pic de cage. Pour déterminer les niveaux d’expression de transcription spécifiques aux cellules et aux tissus, sélectionnez la région de pointe de la cage et cliquez sur magnifier la région génomique pour la sélectionner.
Vérifiez l’expression PARK7 dans le type d’intérêt des cellules et des tissus, en explorant la liste d’expression de transcription au bas de la page. Ensuite, concevoir des séquences de domaine contraignantes de plusieurs longueurs différentes correspondant à 40 bases en amont, et 32 bases en aval de la première méthionine ou AUG. Avant la transfection avec les SINEUPs, les cellules de graines d’intérêt sur deux plaques de puits enrobées de poly-d-lysine, telles que décrites dans le manuscrit.
Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de CO2 de cinq pour cent pour atteindre 70 pour cent de confluence. Il est très important de répartir les cellules également dans les puits, à cette fin secouer doucement la plaque 10 fois d’avant en arrière après l’ensemencement des cellules à l’intérieur d’un banc propre, et répéter dans l’incubateur de CO2 de cinq pour cent. Après l’incubation, changer le milieu à 0,4 mL de milieu frais.
Pour analyser SINEUP-GFP faire plusieurs tubes de 1,5 mL avec 0,1 mL de solution mixte, avec pEGFP-C2, SINEUP-GFP, réagents de transfection et OptiMEM dans chaque tube, puis incuber le tube à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez 0,1 mL de cette solution mixte de chaque tube à un puits séparé d’une plaque de puits de 24 puits, et étiquetez ces puits avec SINEUP-GFP un, deux, trois, quatre et cinq. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de CO2 de cinq pour cent pendant 24 heures.
Après 24 heures, laver les cellules avec 0,5 mL de PBS. Ajouter 25uL de 0,05 pour cent de poids par trypsine de volume, et incuber dans un incubateur de CO2 de cinq pour cent pendant cinq minutes. Ajouter 275 uL de milieu cellulaire par puits.
Pour l’extraction des protéines, prendre l’une des deux plaques, et récolter 225uL ou les trois quarts des cellules d’un puits, et 75uL ou un quart des cellules pour l’extraction de l’ARN, chacun dans un tube séparé de 1,5 mL. Centrifugeuse à 6000xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer soigneusement le surnatant du tube étiqueté par isolation protéique.
Ajouter 60uL de solution de lyse aux cellules et mélanger par pipetting Mélanger soigneusement en tournant à basse vitesse pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifugez le tube à 14 000xg pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les protéines supernatantes. Pour déterminer la concentration en protéines, préparez d’abord cinq à six fois la dilution de la norme de protéine d’albumine de sérum bovin frais dans l’eau ultra-pure, avec des concentrations allant de 0,2 à 1,5 mg/mL de protéines.
Pour préparer le reagent de travail Un mélange Dash ajouter 20uL de réagencé S à un mL de reagent A dans un tube de deux mL. Ajouter cinq uL d’eau comme un contrôle négatif. Et puis, BSA standard ou échantillon de protéines dans chaque puits.
Ajouter 25uL de reagent A Dash, puis ajouter soigneusement 200uL de reagent B par puits, en évitant toute formation de bulle. Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour l’incuber à température ambiante, pendant cinq à huit minutes. Mesurer l’absorption des protéines à 750 nm à l’l’insurgiromètre.
Préparez une courbe standard en traçant les concentrations de protéines standard bsa sur l’axe x, et leur absorption respective sur l’axe y. Appliquer une équation de courbe standard pour calculer la concentration de protéines de l’échantillon. Pour commencer la séparation des protéines, ajoutez un volume de colorant de chargement 2x à chaque volume de l’échantillon de protéines.
Chauffer à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes et laisser refroidir immédiatement sur la glace pendant une minute. Chargez 10 à 20ug d’échantillons de protéines à 10 pour cent de gel polyacrylamide SDS et séparez-les à 100 à 150V. Transférer la protéine du gel à une membrane de nitrocellulose de 0,5 micromètre, par un instrument de transfert semi-sec.
Remplir de tampon de transfert à 25V pendant 30 minutes. Après le transfert, placez la membrane dans un récipient et ajoutez une solution de blocage jusqu’à ce que la membrane soit complètement trempée et incubez-la à température ambiante pendant 30 minutes en secouant. Ajouter l’anticorps approprié à la solution de blocage et verser sur la membrane.
Hybrider en incubant la membrane pendant 30 minutes à température ambiante, tout en secouant. Après l’hybridation, laver la membrane en ajoutant 1x tampon TBST pendant cinq minutes à température ambiante, et répéter deux fois de plus. Effectuez l’hybridation suivante avec un anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage sur la membrane, à température ambiante pendant 30 minutes tout en secouant.
Ensuite, lavez la membrane en ajoutant 1x tampon TBST pendant cinq minutes à température ambiante, et répétez deux fois de plus. Transférer la membrane dans une boîte remplie de deux mL de mélange de reagent ECL amélioré par HRP. Couvrir la boîte de papier d’aluminium et incuber pendant une à deux minutes à température ambiante.
Retirez soigneusement la membrane du mélange de reagent ECL et exposez-la à l’aide d’un instrument d’imagerie par luminescence. Pour analyser l’effet de SINEUP-GFP dans les cellules par imagerie, lavez le pEGFP-C2, et les cellules transectées SINEUP-GFP de la deuxième plaque de puits 24 avec 0,5 mL de PBS par puits. Pour tacher le noyau, ajouter 2ug de Hoechst-33342 à chaque puits, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius, pendant 20 minutes.
Utilisez un cytomètre d’image microwell à haut débit pour mesurer les cellules tachées hoechst, pour compter le nombre total de cellules. Mesurer l’intensité de la fluorescence verte pour compter le nombre de cellules positives gfp. Pour analyser, l’effet de régulation des protéines des SINEUPs, utiliser un logiciel d’imagerie pour déterminer une intensité intégrée GFP Calculer comme la somme de toutes les intensités de pixels affichant des signaux dans des objets segmentés obtenus pour chaque canal.
Après une transfection réussie avec SINEUP-GFP, un SINEUP synthétique contenant à la fois un domaine de liaison optimal et un domaine effecteur GFP, la traduction de l’ARNm a été régulée sans changer l’expression de l’ARNm GFP. Un protocole d’analyse d’image semi-automatisée a amélioré le temps de détection et augmenté le nombre d’échantillons examinés simultanément par rapport à une analyse classique des taches occidentales. Bien qu’il y ait eu une différence dans l’intensité du signal, de 2,6 fois dans l’analyse des taches occidentales à 1,4 fois dans l’analyse d’imagerie, des niveaux significativement plus élevés de fluorescence GFP ont été détectés par rapport au contrôle.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’identifier la séquence correcte des ARNN cibles pour concevoir le domaine de liaison correct. Les gènes sont souvent transcrits par des promoteurs et peuvent utiliser différents sites d’initiation à la traduction. Le navigateur Zenbu est un outil très utile pour explorer une telle variance de l’ARNm.
Nous suggérons également de concevoir différents SINEUP avec des sites de liaison variable. Au total, nous croyons que l’adaptation rapide des PNA à une multiplicité d’objectifs établira un nouveau domaine consistant en une traduction positivement réglementée des ARN existants, ce qui est réciproque et complémentaire au domaine du siRNA. Une partie de ces fonctions, nous envisageons que cette technologie sera instrumentale pour produire de plus grandes quantités de protéines in vitro, comme les bioréacteurs, ainsi que in vivo pour corriger naturellement le dosage du gène.
