פרוטוקול זה מספק הוראות לבנייה ושימוש במערכת פוטוביוקטור של עמודת בועה לגידול מיקרו-אצות, וצריך לעניין את כל מי שלומד דלק ביולוגי של אלגל, טיפול בשפכים או ביולוגיה של אלגל. מצאנו את מערכת כור הצריח כדי לייצר תוצאות מכובדות ביותר. מערכת הכור ניתנת להתאמה אישית גם למגוון רחב של אצות ועולה הרבה פחות מהנפקות מסחריות רבות.
הדגמת ההליך תהיה צ'יצ'ן וונג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהתקנה של Photobioreactors עמודת בועה, לבנות קבוצה של מכסים מאווררים מן מכסי הפלסטיק של בקבוקי זכוכית ליטר אחד צינורות הכלאה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להחליק טבעת O 1/4 אינץ' מעל העקבות של 1/8 אינץ' לוח הר פיתוי הולם, ולהחליק את זה לתוך החור 1/4 אינץ' קדח במכסה.
להחליק שני 1/4 אינץ ' מעל החוטים, כך המכסה הוא דחוק בין שתי טבעות O. ואז להחליק אגוז מנעול על החוטים ולהדק אותו כדי לתקן את הפיתוי הר הלוח במקום. עכשיו הצמד לנעול טבעות על הפיתוי הגברי חשוף, מקרין מהמכסה.
חזור על הליך זה עבור כל חור במכסה. עבור מכסים שישמשו על עמוד הבועה וכורי בקבוק, לצרף 1/8 אינץ' נקבה פיתוי 1 1/2 חתיכות אינץ ' של צינורות PVC מזהה 1/8 אינץ'. צרף אותם לכל אחד מאביזרים פיתוי זכר חשוף על המכסה.
חבר שסתום בדיקה לקצה החופשי של אחד החלקים בגודל 1/8 אינץ'. ואז לחבר פיתוי זכר דוקרני הולם את החלק השני של צינורות 1/8 אינץ' מקרין מהמכסה. לחץ על טבעת הנעילה המסתובבת למקומה והדק מסנן אוויר של 0.2 מיקרון למצב זה.
הרכבת Compleat של האוויר לספק מערכת, מיכלי דגים, מערבבים צלחות, ואורות כפי שנוהג אותו פרוטוקול הטקסט. רכז את מלאי המיקרו-אצות המיושב על-ידי הסרת העל-טבעי באמצעות משאבת ואקום. השאירו פחות מ-100 מיליליטר של מדיום בכל בקבוק, אך הימנעו מהסרת אצות מיושבים.
להשעות ולהעביר את תרחיף אצות לצינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מיליליטר. צנטריפוגה 1, 000 פעמים G במשך חמש דקות כדי לרכז עוד יותר את האצות. ב ארון biosafety, להסיר מספיק על טבעי כדי להשיג נפח כולל של כ 80 מיליליטר של תרכיזי אצות עבור 12 פוטוביורקטורים.
הימנע שאיבת אבק את גלולה. מעבירים את תרכיז האצות למיכל סטרילי. עכשיו, להוסיף שישה מיליליטר של תרחיף אצות לכל פוטוביוקטור עם פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר.
מערבלים את הביו-חומרים כדי לערבב אצות במדיום. צייר דגימה של שני מיליליטר מכל ביו-ריאקטור באמצעות פיפטה סרולוגית והעבר לצינור של שני מיליליטר. לאסוף מדגם שני מיליליטר כל 24 שעות כדי לפקח על התקדמות התרבות.
בדוק את המדגם עבור ph באמצעות פסי בדיקה ולהתאים את הכור לפי הצורך. הדקו את מכסי הביו-ריאה והכנסו את כל הביו-חומרים לאמבט המים של מיכלי הדגים. התאימו את התזוזה, הפחמן הדו-חמצני והתאורה לרמות המתאימות למין.
סובב את מיקום הביו-ראקטור כל יום לאחר הדגימה. החל 200 microliters של כל מדגם תרבות ב- triplicate על בארות של 96 מיקרופלסטיק היטב. לאחר מכן למדוד צפיפות אופטית ב 550 ננומטר ו 680 ננומטר.
למדוד נפח קבוע של תרבות אצות מכל bioreactor עם גליל בוגר ולהעביר בקבוקי צנטריפוגה. צנטריפוגה התרבות 4, 696 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי על-ידי שאיבתו בזהירות.
העבר את כדורי שכותרתו 50 צינורות מיליליטר. שוטפים את בקבוקי הצנטריפוגה במים מזוקקים ומעבירים את התכולה לצינורות 50 מיליליטר. ודא שהנפח הכולל אינו עולה על 45 מיליליטר.
לאחר שטיפת כדורי האצות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השלך את העל-טבעי. לאחר מכן, להוסיף 7.5 מיליליטר של מים מזוקקים לכל צינור 50 מיליליטר. עכשיו, מערבולת צינורות 50 מיליליטר ולהעביר את תרחיף האצות לתוך צינורות 15 מיליליטר שקל מראש.
לשטוף את צינורות 50 מיליליטר עם מים מזוקקים נוספים, ולהעביר את הנוזל לצינורות 15 מיליליטר שמירה על נפח הכולל בצינורות אלה פחות מ 12 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של 15 צינורות מיליליטר והשליכת העל-טבעי כבעבר, להקפיא את הצינורות עם כדורי במינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות כהכנה לייבוש הקפאה. הוסף 1.5 מיליליטר של ממס חומצה טפש לכל צינור שני מיליליטר המכיל 20 מיליגרם של אצות מיובשות הקפאה.
יוצקים כ 0.5 מיליליטר של זירקוניה סיליקה חרוזים לתוך כל צינור עד רמת הנוזל מגיע שני מיליליטר. הומוגניזציה של דגימות האצות במפעל חרוזים למשך 20 שניות במהירות של 6.5 מטרים לשנייה. מעבירים את הצינורות לקרחים למשך 30 שניות כדי לצנן את הדגימות.
לאחר מכן, לחזור חמש פעמים נוספות כדי לחלץ באופן מלא את השומנים. לסנן את homogenate דרך מזרק חמישה מיליליטר המכיל דיסק רשת חוט נירוסטה כדי לסנן את חרוזים, איסוף סינון בצינור 15 מיליליטר. לשטוף את חרוזים עם 1.5 מיליליטר של ממס folch, דוחף נוזל דרך עם המזרק לפי הצורך.
חזור על שטיפה זו 2 פעמים נוספות ולאסוף את כל הסינון בצינור 15 מיליליטר, מניב נפח סופי של כשישה מיליליטר. הוסיפו 1.2 מיליליטר של תווי נתרן כלורי של 0.9% לתמצית האיוולת בצינור ה-15 מיליליטר, ומערבולת כדי לערבב היטב. צנטריפוגה צינורות 15 מיליליטר ב 6, 000 פעמים G במשך חמש דקות.
רשום את נפח פאזה כלורופורם התחתון הקרוב ביותר 0.1 מיליליטר באמצעות קווים בצד של הצינור 15 מיליליטר. ואז להעביר את השלב התחתון לזכוכית נתעבת באמצעות פיפטה מרעה זכוכית. כדי לבצע את בדיקת השומנים הניטרלית, לדלל את תמציות השומנים ושמן צמחי סטנדרטי פי שלושה עם מתנול.
עבור כל מדולל, מדגם להוסיף 80 microliters ל 96 מיקרופלאט פוליפרופילן היטב quadruplicate. עבור ריק ממס, להחיל 80 microliters של ממס פולך quadruplicate. לתקנים, הוסיפו 10, 30, 60, 90 ו-120 מיקרוליטרים של תקן שמן צמחי מדולל גם הם במרובע.
מניחים את המיקרופלאט במכסה המנוע של האדים על תנור בלוק יבש שחומם מראש ב-55 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות עד שכל הממס מתאדה. מוציאים את המיקרופלסטיק מבלוק החימום ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של אלכוהול isopropyl לכל באר ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
ודאו שכל ערוצי הפיפט מערבבים את הפתרון ומערבבים מחדש את השומנים, ונותנים נוזל ירוק הומוגני. עכשיו, להוסיף 200 microliters של מיקרוגרם אחד למיליליטר פתרון אדום הנילוס לכל באר, ולהצינור אותו למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של 50% אקונומיקה לכל באר, והוסיפו אותה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לערבב היטב.
השאירו את הפלטה כדי דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, לקרוא את florescence בדגימות כל חמש עד 10 דקות ב 530 ננומטר בעירור, 575 ננומטר פליטה, עם ניתוק אוטומטי מוגדר 570 ננומטר עד האות מדגימות אצות מתייצב. הליך זה מניב קורס זמן של נתוני צפיפות אופטית אלגל ב OD 550 ננומטר.
תרבות הבקרה גדלו על מדיום NH4 אנט טרי. טיפול אחד, הוא תרבויות שיתוף auxenochlorella פרוטותקוידים ו brasiliense azospirillum גדל על מדיום NH4 innate טרי. טיפול שני, הוא A.Protothecoides azinic גדל על מדיום NH4 innate בתוספת 50 מיליגרם למיליליטר IAA, אשר עיכב לחלוטין את צמיחת האצות.
טיפול שלישי, הוא azinic A.Protothecoides, גדל על בינוני בילה מ A.Brasilienes. עקומות הצמיחה מראות תרבויות של פרוטותקוידים auxenochlorella להיכנס צמיחה לוגריתמית מאוחרת ב 120 שעות. להלן עקומות ליבה בין הצפיפות האופטית ב-550 ננומטר לבין ריכוז המשקל היבש הסופי, תוך שימוש בכושר פולינומיאלי מסדר שני.
לבסוף, ניתן להחיל את הצבע על נתוני הצפיפות האופטית של קורס הזמן כדי להשיג עקומת צמיחה במשקל יבש. אותם טיפולים משמשים כאן, למעט כי כלורלה sorokiniana הוא תרבותי במקום פרוטותקוידים auxenochlorella. אחוז שומנים ניטרליים במשקל יבש המתקבלים באסק השומנים הניטרלי מתואמים היטב עם תוכן טריוס גליצרול על צלחת כרומטוגרפיה תואמת שכבה דקה.
בניגוד ל-A.Protothecoides, הטיפול ב-IAA לא עיכב את צמיחת C.Sorkiniana. לאחר מיצוי השומנים של האצות, ניתן לנתח את משטח התא הנותר עבור עמילן ותוו קיר התא שלה, מתן תמונה מפורטת יותר של מוצרי אחסון אנרגיה בתוך התא. השיטות המתוארות כאן אפשרו תגליות חדשות בתחום דלק ביולוגי אלגל וטיפול בשפכים.
באופן ספציפי, מערכת זו שימשה כדי להבין טוב יותר כיצד חיידקים משפיעים על צמיחת אלגל.
