Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

Questo protocollo fornisce istruzioni per la costruzione e l'uso di un sistema di fotobioreattori a colonna di bolle per coltivare microalghe e dovrebbe essere di interesse per chiunque studi i biocarburanti algel, il trattamento delle acque reflue o la biologia dell'algel. Abbiamo scoperto che il sistema del reattore a guglia produce risultati altamente affidabili. Il sistema del reattore è anche personalizzabile in un ampio gruppo di alghe e costa molto meno di molte offerte commerciali.

A dimostrare la procedura sarà Qichen Wang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare la configurazione dei fotobioreattori Bubble Column, costruire una serie di coperchi ventilati dai coperchi di plastica delle bottiglie di vetro da un litro e tubi di ibridazione come descritto nel protocollo di testo. Infilare un anello O da 1/4 di pollice sui battistrada di un raccordo di esca da 1/8 di montaggio del pannello e far scorrere questo nel foro da 1/4 di pollice praticato nel coperchio.

Infilare un secondo 1/4 di pollice sui fili in modo che il coperchio sia inserito tra i due anelli O. Quindi infilare un dado di blocco sui fili e stringerlo per fissare l'esca di montaggio del pannello in posizione. Ora aggancia per bloccare gli anelli sull'esca maschile esposta, sporgendo dal coperchio.

Ripetere questa procedura per ogni foro nel coperchio. Per i coperchi che verranno utilizzati sui reattori Bubble Column e bottle, collegare l'esca femminile da 1/8 di pollice ai raccordi barb a pezzi da 1/2 pollice di tubi in PVC ID da 1/8 di pollice. Attaccare questi a ciascuno dei raccordi di esca maschile esposti sul coperchio.

Collegare una valvola di ritegno all'estremità libera di uno dei pezzi da 1/8 di pollice. Quindi collegare un'esca maschile al raccordo barb al secondo pezzo di tubi da 1/8 di pollice sporgenti dal coperchio. Fare clic sull'anello di blocco rotante in posizione e fissare un filtro dell'aria da 0,2 micron a questo.

Compleat assembly del sistema di consegna dell'aria, serbatoi di pesce, piastre di agitazione e luci come descriva il protocollo di testo. Concentrare il materiale di microalghe stabilizzato rimuovendo il supernatente utilizzando una pompa per vuoto. Lasciare meno di 100 millilitri di mezzo in ogni bottiglia, ma evitare di rimuovere le alghe sistemate.

Sospendere e trasferire i liquami di alghe in tubi sterili di centrifuga da 50 millilitri. Centrifuga 1.000 volte G per cinque minuti per concentrare ulteriormente le alghe. Nell'armadio della biosicurezza, rimuovere abbastanza supernatente da ottenere un volume totale di circa 80 millilitri di concentrati di alghe per 12 fotobioreattori.

Evitare di aspirare il pellet. Trasferire il concentrato di alghe in un contenitore di steril. Ora, aggiungi sei millilitri di liquami di alghe in ogni fotobioreattore con una pipetta sierologica steril da 10 millilitri.

Ruotare i bioreattori per mescolare le alghe nel mezzo. Esegnare un campione di due millilitri da ogni bioreattore utilizzando una pipetta sierologica e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Raccogli un campione di due millilitri ogni 24 ore per monitorare i progressi della cultura.

Controllare il campione per il ph utilizzando strisce di prova e regolare il reattore in base alle esigenze. Stringere i coperchi del bioreattore e posizionare tutti i bioreattori nel bagno d'acqua del serbatoio del pesce. Regolare l'aerazione, l'anidride carbonica e l'illuminazione ai livelli appropriati per la specie.

Ruotare la posizione del bioreattore ogni giorno dopo il campionamento. Applicare 200 microlitri di ogni campione di coltura in triplice copia su pozzi di una micropiatta da 96 pozzi. Quindi misurare la densità ottica a 550 nanometri e 680 nanometri.

Misurare un volume fisso di coltura di alghe da ogni bioreattore con un cilindro laureato e trasferire in bottiglie di centrifuga. Centrifuga la cultura 4.696 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante aspirandolo con cura.

Trasferire i pellet in tubi etichettati da 50 millilitri. Risciacquare le bottiglie di centrifuga con acqua distillata e trasferire il contenuto nei tubi da 50 millilitri. Assicurarsi che il volume totale non superi i 45 millilitri.

Dopo aver lavato i pellet di alghe come descritto nel protocollo di testo, scartare il supernatente. Quindi, aggiungere 7,5 millilitri di acqua distillata a ogni tubo da 50 millilitri. Ora, vortice i tubi da 50 millilitri e trasferire i fanghi di alghe in tubi pre pesati da 15 millilitri.

Risciacquare i tubi da 50 millilitri con acqua distillata aggiuntiva e trasferire il liquido nei tubi da 15 millilitri mantenendo il volume totale in tali tubi a meno di 12 millilitri. Dopo aver centrifugato i tubi da 15 millilitri e aver scartato il supernatente come prima, congelare i tubi con pellet a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti in preparazione alla liofilizzazione. Aggiungere 1,5 millilitri di solvente di folch a ciascun tubo di due millilitri contenente 20 milligrammi di alghe liofilizzato.

Versare circa 0,5 millilitri di perline di silice di zirconia in ogni tubo fino a quando il livello del liquido raggiunge due millilitri. Omogeneizzare i campioni di alghe in un mulino perline per 20 secondi ad una velocità di 6,5 metri al secondo. Trasferire i tubi sui ghiacci per 30 secondi per raffreddare i campioni.

Quindi, ripetere altre cinque volte per estrarre completamente i lipidi. Filtrare l'omogeneato attraverso una siringa da cinque millilitri contenente un disco in rete metallica in acciaio inossidabile per filtrare le perline, raccogliendo il filtrato in un tubo da 15 millilitri. Lavare le perline con 1,5 millilitri di solvente folch, spingendo il liquido attraverso con il siringo se necessario.

Ripetere questo lavaggio altre 2 volte e raccogliere tutto il filtrato nel tubo da 15 millilitri, producendo un volume finale di circa sei millilitri. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% all'estratto di folch nel tubo da 15 millilitri e al vortice per mescolare bene. Centrifugare i tubi da 15 millilitri a 6.000 volte G per cinque minuti.

Registrare il volume inferiore della fase cloroformio allo 0,1 millilitro più vicino utilizzando linee sul lato del tubo da 15 millilitri. Quindi trasferire la fase inferiore in una vile di vetro utilizzando una pipetta da pascolo in vetro. Per eseguire il saggio lipidico neutro, diluire gli estratti lipidici e l'olio vegetale standard tre volte con metanolo.

Per ogni diluito, il campione aggiunge 80 microlitri a una micropiatta di polipropilene a 96 polietilene in quadruplicato. Per il bianco solvente, applicare 80 microlitri di solvente folch in quadruplicata. Per gli standard, aggiungere 10, 30, 60, 90 e 120 microlitri dello standard di olio vegetale diluito anche in quadruplicato.

Posizionare la micropiatta nella cappa dei fumi su un riscaldatore a blocchi secchi preriscaldato a 55 gradi Celsius per 20-30 minuti fino a quando tutto il solvente non è evaporato. Rimuovere la micropiatta dal blocco riscaldante e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 30 microlitri di alcol isopropile ad ogni pozzo e mescolare pipettando su e giù.

Assicurarsi che tutti i canali di pipetta mescolano la soluzione e rimorsino i lipidi, producendo un liquido verde omogeneo. Ora, aggiungere 200 microlitri di un microgrammo per millilitro a una soluzione rosso nilo ad ogni pozzo e condirlo su e giù 10 volte per mescolare. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere 20 microlitri di soluzione di candeggina al 50% a ciascun pozzo e tubazione su e giù cinque volte per mescolare bene.

Lasciare la piastra per incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, leggere la florescenza nei campioni ogni cinque-10 minuti a 530 nanometri di eccitazione, emissione di 575 nanometri, con tagli automatici impostati a 570 nanometri fino a quando il segnale proveniente dai campioni di alghe non si stabilizza. Questa procedura produce un corso di tempo dei dati di densità ottica algel a 550 nanometri OD.

Le colture di controllo sono state coltivate su un mezzo NH4 fresco. Trattamento uno, è co-colture auxenocloroella prototecoidi e azospirillum brasiliense coltivati su mezzo NH4 fresco innato. Trattamento due, è un A.Protothecoides azinico coltivato su mezzo NH4 innato integrato con 50 milligrammi per millilitro AIA, che ha completamente inibito la crescita delle alghe.

Trattamento tre, è azinico A.Protothecoides, coltivato su mezzo speso da A.Brasilienes. Le curve di crescita mostrano che le colture di auxenoclorella prototecoidi entrano nella crescita logaritmica tardiva a 120 ore. Qui sono mostrate le curve di corelazione tra la densità ottica a 550 nanometri e la concentrazione finale di peso secco, utilizzando una vestibilità polinomiale di secondo ordine.

Infine, la colorazione può essere applicata ai dati di densità ottica del corso del tempo per ottenere una curva di crescita del peso secco. Qui vengono utilizzati gli stessi trattamenti, tranne per il fatto che la clorella sorokiniana viene coltivata al posto dei prototecoidi dell'auxenocloroella. La percentuale di lipidi neutri a peso secco ottenuti nel saggio lipidico neutro è correlata bene con il contenuto di glicerolo triosio su una corrispondente lastra di cromatografia a strato sottile.

A differenza degli A.Protothecoides, il trattamento IAA non inibisce la crescita della C.Sorkiniana. Dopo l'estrazione lipidica delle alghe, il pallet cellulare rimanente può essere analizzato per il suo contenuto di amido e parete cellulare, fornendo un quadro più dettagliato dei prodotti di accumulo di energia all'interno della cellula. I metodi qui descritti hanno permesso nuove scoperte nel campo dei biocarburanti algel e del trattamento delle acque reflue.

In particolare, questo sistema è stato utilizzato per capire meglio come i batteri influenzano la crescita dell'algel.