Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Bau und die Verwendung eines Bubble Column Photobioreaktor-Systems zum Anbau von Mikroalgen und sollte für jeden von Interesse sein, der Algel-Biokraftstoffe, Abwasserbehandlung oder Algelbiologie studiert. Wir haben das Turmreaktorsystem gefunden, um hoch angesehene Ergebnisse zu erzielen. Das Reaktorsystem ist auch an ein breites Algengewirr anpassbar und kostet weit weniger als viele kommerzielle Angebote.

Demonstriert wird das Verfahren von Qichen Wang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Um mit dem Aufbau der Bubble Column Photobioreaktors zu beginnen, konstruieren Sie einen Satz belüfteter Deckel aus den Kunststoffdeckeln der Einliter-Glasflaschen und Hybridisierungsrohre, wie im Textprotokoll beschrieben. Schieben Sie einen 1/4 Zoll O-Ring über die Stufen einer 1/8-Zoll-Panel-Köder-Fitting-Fitting, und schieben Sie dies in das 1/4 Zoll Loch in den Deckel gebohrt.

Schieben Sie einen zweiten 1/4 Zoll über die Gewinde, so dass der Deckel zwischen den beiden O-Ringen eingeklemmt ist. Dann schieben Sie eine Verriegelungsmutter auf die Fäden und ziehen Sie sie fest, um die Platte montieren Köder an Ort und Stelle zu fixieren. Jetzt schnappen, um Ringe auf den exponierten männlichen Köder zu sperren, projiziert aus dem Deckel.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Loch im Deckel. Für Deckel, die auf der Blasensäule und Flaschenreaktoren verwendet werden, befestigen Sie 1/8 Zoll weibliche Köder an Barb Armaturen an 1 1/2 Zoll Stücke von 1/8 Zoll ID PVC-Schläuche. Befestigen Sie diese an jeder der freiliegenden männlichen Köderarmaturen auf dem Deckel.

Schließen Sie ein Rückschlagventil an das freie Ende eines der 1/8 Zoll-Stücke an. Dann verbinden Sie einen männlichen Köder mit Widerhaken, die mit dem zweiten Stück 1/8 Zoll Schlauch projiziert aus dem Deckel. Klicken Sie auf den rotierenden Verriegelungsring und befestigen Sie einen 0,2-Mikron-Luftfilter daran.

Compleat Montage der Luft liefern System, Fischtanks, Rührplatten und Lichter, wie es das Textprotokoll. Konzentrieren Sie den abgesetzten Mikroalgenbestand, indem Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe entfernen. Lassen Sie weniger als 100 Milliliter Medium in jeder Flasche, aber vermeiden Sie das Entfernen von sesshaften Algen.

Die Algenschlämme aufhängen und in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifuge 1.000 mal G für fünf Minuten, um die Algen weiter zu konzentrieren. Entfernen Sie im Biosicherheitsschrank genügend Überstand, um ein Gesamtvolumen von ca. 80 MilliliterAlgenkonzentraten für 12 Photobioreaktoren zu erreichen.

Vermeiden Sie das Absaugen des Pellets. Das Algenkonzentrat in einen sterilen Behälter geben. Fügen Sie nun sechs Milliliter Algenschlämme in jeden Photobioreaktor mit einer sterilen 10 Milliliter serologischen Pipette hinzu.

Die Bioreaktoren verwirbeln, um Algen in das Medium zu mischen. Ziehen Sie eine Zwei-Milliliter-Probe aus jedem Bioreaktor mit einer serologischen Pipette und übertragen Sie in ein Zwei-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie alle 24 Stunden eine Zwei-Milliliter-Probe, um den Kulturfortschritt zu überwachen.

Überprüfen Sie die Probe anhand von Teststreifen auf ph und passen Sie den Reaktor nach Bedarf an. Ziehen Sie die Bioreaktordeckel an und legen Sie alle Bioreaktoren in das Fischtank-Wasserbad. Passen Sie belüftung, Kohlendioxid und Beleuchtung auf die entsprechenden Werte für die Art an.

Drehen Sie die Position des Bioreaktors jeden Tag nach der Probenahme. Tragen Sie 200 Mikroliter jeder Kulturprobe in dreifacher Auslage auf Die Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte auf. Messen Sie dann die optische Dichte mit 550 Nanometern und 680 Nanometern.

Messen Sie ein festes Volumen der Algenkultur aus jedem Bioreaktor mit einem Graduiertenzylinder und transferieren Sie in Zentrifugenflaschen. Zentrifugieren Sie die Kultur 4, 696 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn sorgfältig aussaugen.

Übertragen Sie die Pellets in beschriftete 50-Milliliter-Rohre. Spülen Sie die Zentrifugenflaschen mit destilliertem Wasser und übertragen Sie den Inhalt in die 50 Milliliter-Rohre. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 45 Milliliter nicht überschreitet.

Nach dem Waschen der Algenpellets, wie im Textprotokoll beschrieben, entsorgen Sie das Überstand. Dann fügen Sie 7,5 Milliliter destilliertes Wasser zu jedem 50 Milliliter Rohr hinzu. Nun wirbeln die 50-Milliliter-Röhren aus und übertragen Die Algenschlämme in vorgewogene 15 Milliliter-Röhren.

Spülen Sie die 50 Milliliter-Rohre mit zusätzlichem destilliertem Wasser und übertragen Sie die Flüssigkeit auf die 15 Milliliter-Rohre, wobei das Gesamtvolumen in diesen Röhren auf weniger als 12 Milliliter bleibt. Nach zentrifugieren der 15 Milliliter-Rohre und Wegwerfen des Überstandes wie bisher, die Rohre mit Pellets bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten einfrieren, um sich auf die Gefriertrocknung vorzubereiten. Fügen Sie 1,5 Milliliter Folchlösungsmittel in jede zwei Milliliter Tube mit 20 Milligramm gefriergetrockneten Algen.

Gießen Sie etwa 0,5 Milliliter Zirkonia-Kieselsäure-Perlen in jedes Rohr, bis der Flüssigkeitsstand zwei Milliliter erreicht. Homogenisieren Sie die Algenproben in einer Perlenmühle für 20 Sekunden mit einer Geschwindigkeit von 6,5 Metern pro Sekunde. Übertragen Sie die Rohre für 30 Sekunden auf Eis, um die Proben zu kühlen.

Wiederholen Sie dann fünf weitere Male, um die Lipide vollständig zu extrahieren. Filtern Sie das Homogenat durch eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer Edelstahl-Drahtgitterscheibe, um die Perlen zu belasten und Filtrat in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln. Waschen Sie die Perlen mit 1,5 Milliliter Folch-Lösungsmittel, drücken Sie Flüssigkeit durch mit dem Syring nach Bedarf.

Wiederholen Sie diese Wäsche 2 weitere Male und sammeln Sie alle Filtrat in der 15 Milliliter Tube, was zu einem Endvolumen von etwa sechs Millilitern. Fügen Sie 1,2 Milliliter 0,9%Natriumchloridlösung in den Folh-Extrakt in der 15-Milliliter-Röhre hinzu und Wirbel gut zu mischen. Zentrifugieren Sie die 15 Milliliter-Röhren bei 6.000 mal G für fünf Minuten.

Zeichnen Sie das Volumen der unteren Chloroform-Phase auf die nächsten 0,1 Milliliter mit Linien an der Seite des 15-Milliliter-Rohrs auf. Dann die untere Phase mit einer Glasweidepipette auf einen Glasteufel übertragen. Um den neutralen Lipidtest durchzuführen, verdünnen Sie die Lipidextrakte und pflanzenölStandard dreifach mit Methanol.

Für jede verdünnte Probe fügen Sie 80 Mikroliter zu einer 96 Well Polypropylen Mikroplatte in Quadruplikat hinzu. Für das Lösungsmittel roh, 80 Mikroliter Folchlösungsmittel in Quadruplikat auftragen. Für Normen, fügen Sie 10, 30, 60, 90 und 120 Mikroliter des verdünnten Pflanzenöl-Standard auch in Quadruplicate.

Legen Sie die Mikroplatte in die Dunstabzugshaube auf einen vorgeheizten Trockenblockheizer bei 55 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist. Entfernen Sie die Mikroplatte aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Dann fügen Sie 30 Mikroliter Isopropylalkohol zu jedem Brunnen und mischen durch Pipettieren nach oben und unten.

Stellen Sie sicher, dass alle Pipettenkanäle die Lösung mischen und die Lipide wieder aufhängen, was zu einer homogenen grünen Flüssigkeit führt. Fügen Sie nun 200 Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter eine nilerote Lösung zu jedem Brunnen hinzu, und pfeifen Sie sie 10 Mal nach oben und unten, um sie zu mischen. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 20 Mikroliter 50% Bleichlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und fünfmal nach oben und unten pfeifen, um sie gut zu vermischen.

Lassen Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Nach 30 Minuten lesen Sie die Blütenstände in den Proben alle fünf bis zehn Minuten bei 530 Nanometern Anregung, 575 Nanometer Emission, wobei die Auto-Cut-Offs auf 570 Nanometer eingestellt sind, bis sich das Signal der Algenproben stabilisiert. Dieses Verfahren ergibt einen Zeitlichen Verlauf der algel optischen Dichtedaten bei OD 550 Nanometern.

Kontrollkulturen wurden auf frischem nh4 Medium angebaut. Behandlung eins, ist Ko-Kulturen Auxenochlorella Protothekoide und Azospirillum brasiliense auf frisch angeborenen NH4 Medium angebaut. Behandlung zwei, ist ein azinic A.Protothecoides auf angeborenen NH4 Medium angebaut mit 50 Milligramm pro Milliliter IAA ergänzt, die das Algenwachstum vollständig hemmte.

Behandlung drei, ist azinic A.Protothecoides, auf verbrauchten Medium aus A.Brasilienes angebaut. Die Wachstumskurven zeigen Kulturen von Auxenochlorella-Protothekisiden, die mit 120 Stunden spätlogarithmisches Wachstum aufnehmen. Hier sind Die Hiergezeigten sind Die Korelationskurven zwischen der optischen Dichte bei 550 Nanometern und der endgültigen Trockengewichtskonzentration unter Verwendung einer Polynompassung zweiter Ordnung.

Schließlich kann die Färbung auf die optischen Dichtedaten des Zeitverlaufs angewendet werden, um eine Trockengewichtswachstumskurve zu erhalten. Die gleichen Behandlungen werden hier verwendet, mit der Ausnahme, dass Chlorella sorokiniana anstelle von Auxenochlorella-Protothekoiden kultiviert wird. Prozent Trockengewicht neutrales Lipid, das im neutralen Lipidtest gewonnen wird, korreliert gut mit dem Trioseglyceringehalt auf einer entsprechenden Dünnschichtchromatographieplatte.

Im Gegensatz zu A.Protothecoides hemmte die IAA-Behandlung das C.Sorkiniana-Wachstum nicht. Nach der Lipidextraktion der Algen kann die verbleibende Zellpalette auf ihren Stärke- und Zellwandgehalt analysiert werden, um ein detaillierteres Bild der Energiespeicherprodukte innerhalb der Zelle zu liefern. Die hier beschriebenen Methoden haben neue Entdeckungen im Bereich der Algel-Biokraftstoffe und der Abwasserbehandlung ermöglicht.

Insbesondere wurde dieses System verwendet, um besser zu verstehen, wie Bakterien das Algelwachstum beeinflussen.