Bu protokol, mikroalg büyümek için bir Kabarcık Sütun Luporerere sisteminin inşası ve kullanımı için talimatlar sağlar ve algel biyoyakıt, atık su arıtma veya algel biyolojisi okuyan herkes ilgi olmalıdır. Yüksek itibarlı sonuçlar elde etmek için kule reaktör sistemini bulduk. Reaktör sistemi de yosun geniş bir rang özelleştirilebilir ve çok daha az ticari teklifleri daha maliyeti.
Prosedürü gösteren Qichen Wang, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Kabarcık Sütun Fotobiyoreaktörler kurulum başlamak için, metin protokolü açıklandığı gibi bir litre cam şişe ve hibridizasyon tüpleri plastik kapaklar havalandırmalı kapakları bir dizi inşa. Bir 1/8th panel montaj cazibesi uydurma sırtları üzerinde bir 1/4 inç O halka slip, ve kapak delinmiş inç delik içine bu slayt.
Kapağı iki O halkaları arasında sıkışmış böylece iplikleri üzerinde ikinci bir inç slip. Sonra iplikler üzerine bir kilit somun kayma ve yerinde panel montaj cazibesi düzeltmek için sıkın. Şimdi kapaktan yansıtılan, maruz erkek cazibesi üzerine halkaları kilitlemek için tutturun.
Kapaktaki her delik için bu yordamı tekrarlayın. Kabarcık Sütun ve şişe reaktörleri kullanılacak kapaklar için, 1 / 8th inç ID PVC boru 1 1 /2 inç adet barb parçaları için 1/8th inç dişi cazibesi nifak takın. Bunları kapaktaki açıkta kalan erkek yem parçalarının her birine takın.
1/8th inç parçalarından birinin serbest ucuna bir çek valfi bağlayın. Sonra kapaktan yansıtılan 1/8th inç boru ikinci parçasına barb uydurma bir erkek cazibesi bağlayın. Yerine dönen kilit halkasını tıklatın ve buna 0,2 mikronluk bir hava filtresi bağlayın.
Hava teslim sistemi Compleat montaj, balık tankları, karıştırma plakaları, ve ışıklar olarak metin protokolü descried. Bir vakum pompası kullanarak supernatent kaldırarak yerleşmiş mikroalg stok konsantre. Her şişede 100 mililitreden az orta tane bırakın, ancak yerleşmiş yosunları çıkarmaktan kaçının.
Askıya almak ve steril 50 mililitre santrifüj tüpler için yosun bulamaç aktarın. Algleri daha fazla yoğunleştirmek için 5 dakika için 1000 kat G santrifüj. Biyogüvenlik kabininde, 12 fotobiyoreaktörler için yaklaşık 80 mililitre yosun konsantresi hacmine ulaşmak için yeterli supernatent kaldırın.
Peletvakumlama kaçının. Yosun konsantresini steril bir konteynere aktarın. Şimdi, her bir fotobiyorere 10 mililitre serolojik pipetle altı mililitre yosun bulamacı ekleyin.
Yosunları ortama karıştırmak için biyoreaktörleri döndürün. Serolojik pipet kullanarak her biyoreaktörden iki mililitrelik bir numune çekin ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Kültür ilerlemesini izlemek için her 24 saatte bir iki mililitrelik bir örnek toplayın.
Test şeritleri kullanarak ph örneğini kontrol edin ve reaktörü gerektiği gibi ayarlayın. Biyoreaktör kapaklarını sıkın ve tüm biyoreaktörleri akvaryum su banyosuna yerleştirin. Havalandırma, karbondioksit ve aydınlatmayı türler için uygun seviyelere ayarlayın.
Örneklemeden sonra biyoreaktör pozisyonunu her gün döndürün. 96 kuyumikroplaka kuyularına üç eklik olarak her kültür örneğinden 200 mikrolitre uygulayın. Sonra 550 nanometre ve 680 nanometre optik yoğunluğu nu ölçün.
Bir lisansüstü silindir ve santrifüj şişelerde transfer ile her biyoreaktör yosun kültürünün sabit bir hacim ölçün. Beş dakika için kültür 4, 696 kez G santrifüj. Dikkatlice vakumlayarak supernatent atın.
Peletleri etiketli 50 mililitrelik tüplere aktarın. Distile su ile santrifüj şişeleri durulayın ve 50 mililitre tüpler için içeriğini aktarın. Toplam hacmin 45 mililitreyi geçmediğinden emin olun.
Metin protokolünde açıklandığı gibi yosun peletleri yıkadıktan sonra, supernatent atın. Daha sonra, her 50 mililitrelik tüp e 7,5 mililitre distile su ekleyin. Şimdi, girdap 50 mililitre tüpler ve önceden tartılmış içine yosun bulamaç transfer 15 mililitre tüpler.
50 mililitrelik tüpleri ilave distile suyla durulayın ve sıvıyı bu tüplerdeki toplam hacmi 12 mililitreden daha az tutan 15 mililitrelik tüplere aktarın. 15 mililitrelik tüpleri santrifüj ettikten ve daha önce olduğu gibi supernatent attıktan sonra, dondurulması için hazırlık en az 30 dakika eksi 80 santigrat derece pelet ile tüpler dondurun. Her iki mililitrelik tüp 20 dondurma kurutulmuş yosun içeren folch çözücü 1,5 mililitre ekleyin.
Sıvı seviyesi iki mililitre ulaşana kadar her tüp içine zirkon silika boncuk yaklaşık 0,5 mililitre dökün. Alg örneklerini bir boncuk değirmeninde saniyede 6,5 metre hızla 20 saniye homojenize edin. Örnekleri soğutmak için tüpleri 30 saniye boyunca buzlara aktarın.
Sonra, tamamen lipidler ayıklamak için beş kez daha tekrarlayın. 15 mililitrelik bir tüp içinde filtrasyon toplayarak boncukları gerilmek için paslanmaz çelik tel örgü disk içeren beş mililitrelik şırınga ile homojen filtre uygulayın. Boncukları 1,5 mililitre folch çözücü ile yıkayın ve sıvıyı gerektiği gibi syring ile itin.
Bu yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın ve yaklaşık altı mililitrelik son bir hacim vererek 15 mililitrelik tüpteki tüm filtratları toplayın. 15 mililitrelik tüpteki folch ekstresine %0,9 sodyum klorür çözeltisi ve iyice karıştırmak için girdap ekleyin. Santrifüj 15 mililitre tüpler itrifüj 6, 000 kez G beş dakika için.
15 mililitrelik tüpün yan tarafındaki çizgileri kullanarak alt kloroform faz hacmini en yakın 0,1 mililitreye kaydedin. Sonra bir cam mera pipet kullanarak bir cam aşağılık alt faz aktarın. Nötr lipid test gerçekleştirmek için, metanol ile lipid özleri ve bitkisel yağ standart üç kat seyreltmek.
Seyreltilmiş her biri için numune, 96 iyi polipropilen mikroplakaya dört katına 80 mikrolitre ekleyin. Çözücü boş için, 80 mikrolitre folch çözücüyu dört katına uygulayın. Standartlar için, seyreltilmiş bitkisel yağ standardının 10, 30, 60, 90 ve 120 mikrolitresini de dört katına ekleyin.
Mikroplakayı duman kaputuna, tüm çözücü buharlaşana kadar 55 derecede, 20 ila 30 dakika önceden ısıtılmış kuru blok ısıtıcıya yerleştirin. Isıtma bloğundan mikroplakaçıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Sonra, her iyi için isopropil alkol 30 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın.
Tüm pipet kanallarının çözeltiyi karıştırdığından ve lipitleri yeniden askıya alarak homojen yeşil bir sıvı sağladığından emin olun. Şimdi, her kuyuya mililitre başına bir mikrogram 200 mikrolitre nil kırmızısı bir çözelti ekleyin ve karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı boru. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka dan sonra, her kuyuya %50 çamaşır suyu çözeltisi 20 mikrolitre ekleyin ve iyi karıştırmak için beş kez yukarı ve aşağı boru.
Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın plat bırakın. 30 dakika sonra, 530 nanometre uyarma, 575 nanometre emisyon, otomatik kesme 570 nanometre alg örnekleri sinyal stabilize kadar ayarlanmış her beş ila 10 dakikada bir örneklerdeki floresan okuyun. Bu işlem, OD 550 nanometrelerde algel optik yoğunluk verilerinin bir zaman seyrini verir.
Kontrol kültürleri taze anate NH4 orta büyüdü. Tedavi bir, co-kültürlerauxenochlorella protothecoides ve azospirillum brasiliense taze doğuştan NH4 orta yetiştirilen. Tedavi iki, doğuştan NH4 orta mililitre IAA başına 50 miligram ile desteklenen yetiştirilen bir azinik A.Protothecoides, hangi tamamen yosun büyümesini inhibe.
Tedavi üç, azinik A.Protothecoides, A.Brasilienes harcanan orta yetiştirilen. Büyüme eğrileri auxenochlorella protothecoides kültürleri göstermek 120 saat geç logaritmik büyüme girin. Burada gösterilen 550 nanometre optik yoğunluğu ve son kuru ağırlık konsantrasyonu arasındaki birlikte ilişki eğrileri, ikinci dereceden polinom uyum uymaktadır.
Son olarak, renklendirme kuru ağırlık büyüme eğrisi elde etmek için zaman ders optik yoğunluk verilerine uygulanabilir. Aynı tedaviler burada kullanılır, chlorella sorokiniana auxenochlorella protothecoides yerine kültürlü olması dışında. Nötr lipid testinde elde edilen kuru ağırlık nötr lipid yüzdesi, ilgili ince tabaka kromatografi plakasında triose gliserol içeriği ile iyi ilişkilidir.
A.Protothecoides aksine, IAA tedavi C.Sorkiniana büyümesini inhibe etmedi. Yosun lipid ekstraksiyon uktan sonra, kalan hücre paleti hücre içinde enerji depolama ürünleri daha ayrıntılı bir resim sağlayarak, nişasta ve hücre duvarı içeriği için analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler algel biyoyakıt ve atık su arıtma alanında yeni keşifler sağladı.
Özellikle, bu sistem daha iyi nasıl bakteri algel büyümesini etkilemek anlamak için kullanılmıştır.
