이 프로토콜은 미세 조류를 성장하기 위해 버블 컬럼 광생물 반응기 시스템의 건설 및 사용에 대한 지침을 제공하고, 알겔 바이오 연료, 폐수 처리 또는 알겔 생물학을 공부하는 사람에게 관심을 가져야한다. 우리는 매우 평판 좋은 결과를 생산하기 위해 첨탑 원자로 시스템을 발견했다. 원자로 시스템은 또한 조류의 넓은 울렸다에 사용자 정의 할 수 있으며 많은 상업 제품보다 훨씬 적은 비용.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 Qichen Wang이 될 것입니다. 버블 컬럼 광생물반응기의 설치를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 1리터 유리 병및 혼성화 튜브의 플라스틱 뚜껑에서 통풍구 세트를 구성합니다. 1/8 인치 패널 마운트 루어 피팅의 트레드 위에 1/4 인치 O 링을 미끄러, 뚜껑에 드릴 1/4 인치 구멍으로 이것을 밀어.
뚜껑이 두 O 링 사이에 끼어 있도록 스레드 위에 두 번째 1/4 인치를 미끄러. 그런 다음 잠금 너트를 스레드에 넣고 조여 패널 마운트 미끼를 제자리에 고정시하십시오. 이제 뚜껑에서 투사, 노출 된 남성 미끼에 반지를 잠글 스냅.
뚜껑의 각 구멍에 대해 이 절차를 반복합니다. 버블 컬럼과 병 반응기에서 사용할 뚜껑의 경우 1/8 인치 여성 미끼를 1/8 인치 ID PVC 튜브의 1 1/2 인치 조각에 바브 피팅에 부착하십시오. 뚜껑에 노출된 각 남성 미끼 피팅에 부착합니다.
체크 밸브를 1/8인치 조각 중 하나의 프리 엔드에 연결합니다. 그런 다음 뚜껑에서 투사하는 1/8 인치 튜브의 두 번째 조각에 바브 피팅에 남성 미끼를 연결합니다. 회전 잠금 링을 제자리에 클릭하고 0.2 미크론 공기 필터를 고정합니다.
공기의 컴플리트 조립은 텍스트 프로토콜을 비난으로 시스템, 어수조, 교반 플레이트, 조명을 전달합니다. 진공 펌프를 사용하여 수퍼네티드를 제거하여 정착된 미세조류 재고를 농축한다. 각 병에 100 밀리리터 미만의 매체를 두지만 정착된 조류를 제거하지 마십시오.
축조류 슬러리를 일시 중단하고 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 멸균하도록 이송합니다. 원심분리기 1, 000회 G5분간 5분간 조류를 더 집중시한다. 생물 안전 캐비닛에서 12개의 광생물 반응기용 약 80밀리리터의 조류 농축물의 총 부피를 달성하기에 충분한 수퍼나텐트를 제거합니다.
펠릿을 진공 청소기로 청소하지 마십시오. 해조류 농축액을 멸균 용기로 옮기다. 이제 멸균 된 10 밀리리터 세로지피펫으로 각 광생물 반응기에 6 밀리리터의 조류 슬러리를 추가하십시오.
바이오 반응기를 소용돌이치면 조류를 배지에 섞습니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여 각 생물 반응기에서 2밀리리터 샘플을 끌어서 2밀리리터 튜브로 옮습니다. 배양 진행 상황을 모니터링하기 위해 24시간마다 2밀리리터 샘플을 수집합니다.
테스트 스트립을 사용하여 ph용 샘플을 확인하고 필요에 따라 반응기를 조정합니다. 생물 반응기 뚜껑을 조이고 모든 생물 반응기를 수조 수조에 넣습니다. 식기, 이산화탄소 및 조명을 종에 적합한 수준으로 조정합니다.
샘플링 후 매일 생물 반응기 위치를 회전합니다. 96 개의 잘 마이크로 플레이트의 우물에 삼중 판에 각 배양 샘플의 200 마이크로 리터를 적용합니다. 그런 다음 550 나노미터 및 680 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.
각 생물 반응기에서 각 생물 반응기에서 조류 배양의 고정 된 볼륨을 측정 하 고 원심 분리 병에서 전송. 원심분리기 문화 4, 696회 G 5분간. 조심스럽게 진공 청소기로 슈퍼네이트를 버리십시오.
50 밀리리터 튜브에 펠릿을 전송합니다. 원심분리기 병을 증류수로 헹구고 내용물을 50밀리리터 튜브로 옮기습니다. 총 볼륨이 45 밀리리터를 초과하지 않는지 확인합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 조류 펠릿을 세척한 후, 슈퍼네티드를 폐기한다. 그런 다음 각 50 밀리리터 튜브에 증류수 7.5 밀리리터를 추가합니다. 지금, 50 밀리 리터 튜브를 소용돌이 하 고 사전 무게 15 밀리 리터 튜브에 조류 슬러리를 전송.
50밀리리터 튜브를 추가 증류수로 헹구고 액체를 15밀리리터 튜브로 이송하여 해당 튜브의 총 부피를 12밀리리터 미만으로 유지합니다. 15 밀리리터 튜브를 원심 분리하고 이전과 같이 수퍼나텐트를 폐기한 후 동결 건조를 준비하기 위해 최소 30분 동안 펠릿이 있는 튜브를 영하 80도에서 동결하십시오. 동결 건조 조류 20 밀리그램을 포함하는 각 2 밀리리터 튜브에 1.5 밀리리터의 모브용매를 넣습니다.
액체 수준이 2 밀리리터에 도달할 때까지 각 튜브에 지르코니아 실리카 구슬약 0.5 밀리리터를 붓습니다. 초당 6.5m의 속도로 20초 동안 비드 밀에서 조류 샘플을 균질화합니다. 튜브를 얼음으로 30초 동안 옮겨 샘플을 식힙니다.
그런 다음 5번 더 반복하여 지질을 완전히 추출합니다. 스테인레스 스틸 와이어 메쉬 디스크가 들어있는 5 밀리리터 주사기를 통해 동형어를 걸러 구슬을 변형시키고 15 밀리리터 튜브에서 여과물을 수집합니다. 구슬을 1.5 밀리리터의 모낭 용매로 씻고 필요에 따라 주사기를 통해 액체를 밀어 내보도록 하십시오.
이 세척을 2회 더 반복하고 15 밀리리터 튜브에 모든 여과물을 수집하여 약 6밀리리터의 최종 부피를 산출합니다. 15 밀리리터 튜브의 모름 추출물에 염화 나트륨 용액 0.9%의 1.2 밀리리터를 넣고 소용돌이가 잘 섞어주냅니다. 원심 분리기 15 밀리 리터 튜브 6, 000 회 G5 분 동안.
15 밀리리터 튜브의 측면에 라인을 사용하여 가장 가까운 0.1 밀리리터에 바닥 클로로폼 상 부피를 기록합니다. 그런 다음 유리 목초지 파이펫을 사용하여 하단 단계를 유리 사악한 것으로 옮기합니다. 중성 지질 분석기를 수행하려면 지질 추출물과 식물성 오일 표준을 메탄올로 3배 희석합니다.
각 희석에 대해, 샘플은 4배 에 있는 96개의 잘 폴리프로필렌 마이크로 플레이트에 80마이크로리터를 추가합니다. 용매 블랭크의 경우, 4배 의 모독 용매 80 마이크로리터를 적용하십시오. 표준의 경우 희석된 식물성 오일 표준의 10, 30, 60, 90 및 120 마이크로리터를 4배로 추가합니다.
모든 용매가 증발 할 때까지 20 ~ 30 분 동안 55섭씨 55도의 예열 된 드라이 블록 히터에 연기 후드에 마이크로 플레이트를 놓습니다. 가열 블록에서 마이크로 플레이트를 제거하고 실온으로 식힙니다. 그런 다음 각 웰에 30 마이크로 리터의 이소 프로필 알코올을 추가하고 위아래로 파이프팅하여 혼합합니다.
모든 파이펫 채널이 용액을 혼합하고 지질을 재연하여 균일한 녹색 액체를 생성하도록 보장합니다. 이제 밀리리터당 1마이크로그램의 마이크로리터 200마이크로리터를 각 웰에 나일 레드 용액을 추가하고 10번 위아래로 파이프하여 혼합합니다. 실온에서 5분 간 인큐베이션을 한 후, 각 웰에 50%의 표백제 용액의 20마이크로리터를 넣고 5회 위아래로 파이프하여 잘 섞습니다.
상온에서 30분 동안 플래트에서 배양하세요. 30분 후, 530나노미터 의 발산, 575나노미터 방출시 5~10분마다 시료의 플로레시전을 읽고, 조류 샘플의 신호가 안정될 때까지 자동 차단을 570나노미터로 설정한다. 이 절차는 OD 550 나노미터에서 알겔 광학 밀도 데이터의 시간 과정을 산출합니다.
제어 배양은 신선한 anate NH4 매체에서 성장했다. 치료 1은, 신선한 내래 NH4 배지에서 자란 보조 auxenochlorella 프로토테코이드 및 아조스피릴룸 브라질리엔스입니다. 치료 2, 완전히 조류 성장을 억제 밀리리터 IAA 당 50 밀리그램으로 보충 타고난 NH4 매체에 자란 아지닉 A.Protothecoides입니다.
치료 3, A.Brasilienes에서 소비 된 매체에서 성장 아지닉 A.Protothecoides입니다. 성장 곡선은 auxenochlorella 프로토테코이드의 배양이 120 시간으로 늦은 로그와스믹 성장에 진입한다는 것을 보여줍니다. 여기에 도시된 광학 밀도 550 나노미터와 최종 건조 중량 농도 사이의 상호 관계 곡선이 있으며, 2차 다항체 적합성을 이용하여.
마지막으로, 착색은 시간 과정 광학 밀도 데이터에 적용하여 건식 중량 성장 곡선을 얻을 수 있다. 클로렐라 소로키니아나 대신 auxenochlorella 프로토테코이드 대신 배양된다는 점을 제외하면 동일한 치료법이 여기에 사용됩니다. 중성 지질 분석에서 얻은 퍼센트 건조 중량 중성 지질은 해당 얇은 층 크로마토그래피 플레이트의 트리오 글리세롤 함량과 잘 관련이 있습니다.
A.Protothecoides와는 달리, IAA 처리는 C.Sorkiniana 성장을 억제하지 않았습니다. 조류의 지질 추출 에 이어, 나머지 세포 팔레트는 전분 및 세포 벽 함량에 대해 분석 할 수 있으며 세포 내의 에너지 저장 제품의 보다 상세한 그림을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 알겔 바이오 연료 및 폐수 처리 분야에서 새로운 발견을 가능하게했다.
특히, 이 시스템은 박테리아가 알겔 성장에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 사용되었습니다.
