このプロトコルは、微細藻類を成長させるためにバブルカラムフォトバイオリアクターシステムの構築と使用のための指示を提供し、アルゲルバイオ燃料、廃水処理、またはアルゲル生物学を研究している人にとって興味深いはずです。我々は、非常に評判の高い結果を生成するために尖塔原子炉システムを発見しました。原子炉システムはまた、藻類の広い範囲にカスタマイズ可能であり、多くの商業製品よりもはるかに少ないコストです。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるQichen Wangです。バブルカラムフォトビリアクタのセットアップを開始するには、テキストプロトコルに記載されているように、1リットルのガラスボトルとハイブリダイゼーションチューブのプラスチック製蓋から一連の通気蓋を構築します。1/8インチパネルマウントルアーフィッティングの踏み板の上に1/4インチOリングを滑らせ、蓋に穴を開けた1/4インチの穴にスライドさせます。
蓋が2つのOリングの間に挟まれるように、糸の上に2番目の1/4インチを滑ります。その後、ロックナットをスレッドに滑り込ませ、それを締めてパネルマウントルアーを所定の位置に固定します。今、蓋から突き出て、露出した男性のルアーにロックリングにスナップします。
蓋の穴ごとにこの手順を繰り返します。バブルコラムとボトルリアクタに使用される蓋の場合は、1/8インチID PVCチューブの1 1/2インチピースにバーブフィッティングに1/8インチのメスルアーを取り付けます。蓋に露出した男性のルアーフィッティングのそれぞれにこれらを取り付けます。
1/8インチ片の片方の自由端にチェックバルブを接続します。その後、蓋から突き出た1/8インチチューブの2番目の部分に男性のルアーをバーブフィッティングに接続します。回転ロックリングを所定の位置にクリックし、0.2ミクロンのエアフィルタをこれに固定します。
空気のコンプリートアセンブリは、システム、魚のタンク、攪拌プレート、および光をテキストプロトコルとして提供します。真空ポンプを使用してスーパーナテントを取り除くことによって、定住した微細藻類ストックを濃縮します。各ボトルに培地の100ミリリットル未満を残しますが、落ち着いた藻類を取り除くのは避けてください。
藻類スラリーを吊り下げ、無菌50ミリリットル遠心管に移します。遠心分離機は、さらに藻類を濃縮するために5分間Gを1,000回回行う。バイオセーフティキャビネットでは、12個のフォトバイオリアクターに対して約80ミリリットルの藻類濃縮物の総体積を達成するのに十分なスーパーナテントを取り外します。
ペレットを掃除機をかけないようにします。藻類濃縮物を滅菌容器に移す。今度は、滅菌10ミリリットル血清ピペットを用いて、各フォトバイオリアクターに6ミリリットルの藻類スラリーを加えます。
培地中に藻類を混合するバイオリアクターを旋回します。血清ピペットを使用して各バイオリアクターから2ミリリットルのサンプルを引き出し、2ミリリットルチューブに移します。培養の進行を監視するために、24時間ごとに2ミリリットルのサンプルを収集します。
テストストリップを使用してサンプルのphをチェックし、必要に応じてリアクタを調整します。バイオリアクターの蓋を締め、すべてのバイオリアクターを魚のタンク水浴に入れます。エアーレーション、二酸化炭素、照明を種に適したレベルに調整します。
サンプリング後毎日バイオリアクターの位置を回転させます。各培養サンプルの200マイクロリットルを96ウェルマイクロプレートのウェルに三重に塗布します。その後、550ナノメートルと680ナノメートルで光学密度を測定します。
各バイオリアクターから一定量の藻類培養物を、本校のシリンダーで測定し、遠心分離機ボトルに移します。培養物4、696倍Gを5分間遠心分離する。慎重に掃除機をかけることによってスーパーナテントを捨てます。
ペレットをラベル付き50ミリリットルチューブに移します。遠心分離器ボトルを蒸留水でリンスし、内容物を50ミリリットルのチューブに移します。総容積が45ミリリットルを超えないようにしてください。
テキストプロトコルに記載されているように藻類ペレットを洗浄した後、スーパーナテントを廃棄する。その後、各50ミリリットルのチューブに蒸留水7.5ミリリットルを加えます。さて、50ミリリットルのチューブを渦し、藻類スラリーを15ミリリットルのチューブを予め計量したチューブに移します。
50ミリリットルのチューブを追加の蒸留水でリンスし、液体を15ミリリットルのチューブに移し、それらのチューブの総体積を12ミリリットル未満に保ちます。15ミリリットルのチューブを遠心し、スーパーナテントを以前のように捨ててから、凍結乾燥に備えて少なくとも30分間、ペレットでマイナス80度で凍結します。20ミリグラムの凍結乾燥藻類を含む2ミリリットルのチューブに1.5ミリリットルのフォルチ溶媒を加えます。
液体レベルが2ミリリットルに達するまで、ジルコニアシリカビーズを約0.5ミリリットルずつ各チューブに注ぎます。1秒間に6.5メートルの速度で20秒間、ビーズミルの藻類サンプルを均質化します。サンプルを冷やすために30秒間氷にチューブを移します。
次に、脂質を完全に抽出するためにさらに5回繰り返す。ステンレス鋼のワイヤーメッシュディスクを含む5ミリリットルのシリンジを通してホモゲネートをフィルターし、ビーズを歪み、15ミリリットルチューブに濾液を集めます。1.5ミリリットルのフォルチ溶媒でビーズを洗い、必要に応じて注射器で液体を押し通します。
この洗浄をさらに2回繰り返し、15ミリリットルチューブ内のすべての濾液を回収し、約6ミリリットルの最終体積を得る。15ミリリットルチューブの葉エキスに0.9%の塩化ナトリウム溶液の1.2ミリリットルを加え、よく混ぜる渦を加えます。15ミリリットルチューブを6,000倍Gで5分間遠心分離する。
15ミリリットルチューブの側面の線を使用して、最も近い0.1ミリリットルに下部クロロホルム相体積を記録します。その後、ガラスの牧草地のピペットを使用してガラスの下段に下相を移します。中性脂質アッセイを行うために、メタノールで脂質抽出物及び植物油標準を3倍希釈する。
希釈した各々について、サンプルは4倍に96ウェルポリプロピレンマイクロプレートに80マイクロリットルを加えます。溶剤ブランクの場合は、80マイクロリットルのフォルチ溶媒を4倍に塗布します。規格では、希釈された植物油基準の10、30、60、90、および120マイクロリットルを4倍に加えます。
すべての溶媒が蒸発するまで、予熱した乾燥ブロックヒーターの55°Cで20〜30分間、フュームフードにマイクロプレートを置きます。マイクロプレートを加熱ブロックから取り出し、室温まで冷却します。その後、各ウェルにイソプロピルアルコールの30マイクロリットルを追加し、上下にピペットを入れて混合します。
すべてのピペットチャネルが溶液を混合し、脂質を再懸濁し、均質な緑色の液体を得ることを確認してください。さて、各井戸に1ミリリットル1ミリリットル1マイクログラムの200マイクロリットルを加え、それを上下に10回パイプして混ぜます。室温で5分間のインキュベーションの後、各ウェルに50%漂白剤溶液の20マイクロリットルを加え、それを5回上下にパイプしてよく混ぜます。
プラットを室温で30分間インキュベートしておきます。30分後、530ナノメートルの励起、575ナノメートルの放出で5〜10分ごとにサンプルの蛍光を読み、藻類サンプルからの信号が安定するまで570ナノメートルに設定されます。この手順は、OD 550ナノメートルでアルゲル光学密度データの時間経過を生成します。
コントロール培養は、新鮮なアネイトNH4培地上で栽培された。治療1は、新鮮な先天的なNH4培地上で成長したプロテキノクロレラ原虫とアゾスピリルムブラジリアンセとの共培養である。治療2は、アガエ成長を完全に阻害した1ミリリットルIAAあたり50ミリグラムを添加した先天的なNH4培地上で成長したアジニックA.プロトテコイドである。
治療3は、アジニックA.プロトテコイドであり、A.ブラジリアンから使用済み培地上で成長する。成長曲線は、120時間で後期対数成長に入るオーキセノクロレラ原皮血症の文化を示す。ここに示されているのは、550ナノメートルでの光学密度と最終的な乾燥重量濃度との間の共結合曲線であり、2次多項式適合を用いた。
最後に、着色は、乾燥重量成長曲線を得るために時間経過光学密度データに適用することができる。クロレラ・コロキニアナがプロテトテコイドの代わりに培養される点を除いて、ここでも同じ治療法が使用されています。中性脂質アッセイで得られる%乾燥重量中性脂質は、対応する薄層クロマトグラフィー板上のトリオスグリセロール含有量とよく相関する。
A.プロトテコイドとは異なり、IAA治療はC.ソルキニアナの成長を阻害しなかった。藻類の脂質抽出後、残りの細胞パレットは、そのデンプンおよび細胞壁含有量について分析することができ、細胞内のエネルギー貯蔵産物のより詳細な画像を提供する。ここで説明する方法は、アルゲルバイオ燃料と廃水処理の分野で新たな発見を可能にしました。
具体的には、細菌がアルゲルの成長にどのように影響するかをよりよく理解するために使用されてきました。
