Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Este protocolo fornece instruções para a construção e uso de um sistema fotobioreactor da Coluna bolha para cultivar microalgas, e deve ser de interesse para qualquer pessoa que estude biocombustíveis de algel, tratamento de águas residuais ou biologia algel. Encontramos o sistema de reator spire para produzir resultados altamente respeitáveis. O sistema de reator também é personalizável para um amplo alcance de algas e custa muito menos do que muitas ofertas comerciais.

Demonstrando o procedimento será Qichen Wang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar a configuração dos Fotobioreatores da Coluna bolha, construa um conjunto de tampas ventiladas a partir das tampas plásticas das garrafas de vidro de um litro e tubos de hibridização, conforme descrito no protocolo de texto. Deslize um anel O de 1/4 polegada sobre as marcas de um encaixe de isca de 1/8 polegada e deslize isso para o orifício de 1/4 polegada perfurado na tampa.

Deslize uma segunda polegada de 1/4 sobre os fios para que a tampa seja sanduíche entre os dois anéis O. Em seguida, coloque uma porca de bloqueio nos fios e aperte-a para fixar a isca de montagem do painel no lugar. Agora encaixe para travar anéis na isca masculina exposta, projetando-se a partir da tampa.

Repita este procedimento para cada orifício na tampa. Para tampas que serão usadas na Coluna bolha e reatores de garrafas, conecte isca feminina de 1/8 polegada a encaixes de farpas a peças de 1/2 polegada de tubos de PVC de 1/8 polegadas. Anexe-os a cada um dos encaixes de isca masculino expostos na tampa.

Conecte uma válvula de setenção à extremidade livre de uma das peças de 1/8 polegadas. Em seguida, conecte uma isca masculina ao encaixe de barb ao segundo pedaço de tubo de 1/8 polegada projetando-se da tampa. Clique no anel de bloqueio rotativo no lugar e aperte um filtro de ar de 0,2 mícria para isso.

Montagem compleat do sistema de entrega de ar, tanques de peixe, placas de agitação e luzes como descried-lo o protocolo de texto. Concentre o estoque de microalgas assentado removendo o supernacante usando uma bomba de vácuo. Deixe menos de 100 mililitros de meio em cada garrafa, mas evite remover algas assentadas.

Suspenda e transfira o chorume de algas para tubos de centrífugas de 50 mililitros. Centrifugar 1.000 vezes G por cinco minutos para concentrar ainda mais as algas. No gabinete de biossegurança, remova supernêmes suficientes para alcançar um volume total de aproximadamente 80 mililitros de concentrados de algas para 12 fotobioreatores.

Evite aspirar a pelota. Transfira o concentrado de algas para um recipiente estéril. Agora, adicione seis mililitros de chorume de algas em cada fotobioreator com uma pipeta sorológica de 10 mililitros estéril.

Gire os bioreatores para misturar algas no meio. Desenhe uma amostra de dois mililitros de cada bioreator usando uma pipeta sorológica e transfira para um tubo de dois mililitros. Colete uma amostra de dois mililitros a cada 24 horas para monitorar o progresso da cultura.

Verifique a amostra para ph usando tiras de teste e ajuste o reator conforme necessário. Aperte as tampas do bioreator e coloque todos os bioreatores no banho de água do aquário. Ajuste a aeração, o dióxido de carbono e a iluminação aos níveis apropriados para a espécie.

Gire a posição bioreaatora a cada dia após a amostragem. Aplique 200 microliters de cada amostra de cultura em triplicado a poços de uma microplacão de 96 poços. Em seguida, meça a densidade óptica em 550 nanômetros e 680 nanômetros.

Meça um volume fixo de cultura de algas de cada bioreator com um cilindro de pós-graduação e transfira em garrafas centrífugas. Centrifugar a cultura 4.696 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatent aspirando-o cuidadosamente.

Transfira as pelotas para tubos de 50 mililitros rotulados. Enxágüe as garrafas centrífugas com água destilada e transfira o conteúdo para os tubos de 50 mililitros. Certifique-se de que o volume total não exceda 45 mililitros.

Depois de lavar as pelotas de algas, conforme descrito no protocolo de texto, descarte o supernatent. Em seguida, adicione 7,5 mililitros de água destilada a cada tubo de 50 mililitros. Agora, vórtice os tubos de 50 mililitros e transferir as algas para tubos pré-pesados de 15 mililitros.

Enxágüe os tubos de 50 mililitros com água destilada adicional e transfira o líquido para os tubos de 15 mililitros mantendo o volume total nesses tubos para menos de 12 mililitros. Depois de centrifugar os tubos de 15 mililitros e descartar o supernacante como antes, congele os tubos com pelotas a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos em preparação para a secagem congelante. Adicione 1,5 mililitros de solvente folch a cada tubo de dois mililitros contendo 20 miligramas de algas secas congeladas.

Despeje aproximadamente 0,5 mililitros de contas de sílica de zircônia em cada tubo até que o nível líquido atinja dois mililitros. Homogeneize as amostras de algas em um moinho de contas por 20 segundos a uma velocidade de 6,5 metros por segundo. Transfira os tubos para gelos por 30 segundos para esfriar as amostras.

Em seguida, repita mais cinco vezes para extrair totalmente os lipídios. Filtre o homogeneizar através de uma seringa de cinco mililitros contendo um disco de malha de aço inoxidável para escoar as contas, coletando filtrado em um tubo de 15 mililitros. Lave as contas com 1,5 mililitros de solvente folch, empurrando o líquido através da seringa conforme necessário.

Repita esta lavagem mais 2 vezes e colete todos os filtrados no tubo de 15 mililitros, produzindo um volume final de aproximadamente seis mililitros. Adicione 1,2 mililitros de solução de cloreto de sódio de 0,9% ao extrato de folch no tubo de 15 mililitros e vórtice para misturar bem. Centrifugar os tubos de 15 mililitros a 6.000 vezes G durante cinco minutos.

Registre o volume de fase do clorofórmio inferior para o mililitro mais próximo usando linhas na lateral do tubo de 15 mililitros. Em seguida, transfira a fase inferior para um vile de vidro usando uma pipeta de pastagem de vidro. Para realizar o ensaio lipídado neutro, diluir os extratos lipídides e o óleo vegetal padrão três vezes com metanol.

Para cada diluído, a amostra adiciona 80 microliters a uma microplacão de polipropileno de 96 poços em quadruplicato. Para o solvente em branco, aplique 80 microliters de solvente de folch em quadruplicato. Para as normas, adicione 10, 30, 60, 90 e 120 microliters do padrão de óleo vegetal diluído também em quadruplicato.

Coloque a microplacão no capô da fumaça em um aquecedor de bloco seco pré-aquecido a 55 graus Celsius por 20 a 30 minutos até que todo solvente tenha evaporado. Remova a microplacão do bloco de aquecimento e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, adicione 30 microliters de álcool isopropílico a cada poço e misture por pipetação para cima e para baixo.

Certifique-se de que todos os canais de pipeta estão misturando a solução e reutilizando os lipídios, produzindo um líquido verde homogêneo. Agora, adicione 200 microliters de um micrograma por mililitro uma solução vermelha do nilo para cada poço, e encosto-o para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, adicione 20 microliters de 50% de solução de alvejante para cada poço, e encose-o cinco vezes para misturar bem.

Deixe a placa para incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos, leia a florescence nas amostras a cada cinco a 10 minutos a 530 nanômetros, 575 nanômetros de emissão, com cortes automáticos definidos para 570 nanômetros até que o sinal das amostras de algas estabilize. Este procedimento produz um curso de tempo de dados de densidade óptica algel em OD 550 nanômetros.

Culturas de controle foram cultivadas em meio NH4 fresco. Tratamento um, é co-culturas auxenochlorella protothecoides e azospirillum brasiliense cultivados em meio NH4 inato fresco. Tratamento dois, é um azinic A.Protothecoides cultivado em nh4 médio inato suplementado com 50 miligramas por mililitro IAA, que inibiu completamente o crescimento de algas.

Tratamento três, é azinic A.Protothecoides, cultivado em meio gasto a partir de A.Brasilienes. As curvas de crescimento mostram que culturas de protothecoides auxenochlorella entram em crescimento logarítmico tardio às 120 horas. Aqui são mostradas curvas de corelation entre a densidade óptica em 550 nanômetros e a concentração final de peso seco, usando um ajuste polinomial de segunda ordem.

Finalmente, a coloração pode ser aplicada aos dados de densidade óptica do curso de tempo para obter uma curva de crescimento de peso seco. Os mesmos tratamentos são usados aqui, exceto que a cloroa sorokiniana é cultivada em vez de prototecoides auxenochlorella. Por cento lipídio neutro de peso seco obtido no ensaio lipídado neutro correlaciona-se bem com o teor de glicerol triose em uma placa de cromatografia de camada fina correspondente.

Ao contrário dos A.Protothecoides, o tratamento iaa não inibiu o crescimento da C.Sorkiniana. Após a extração lipídica das algas, a palete celular restante pode ser analisada para seu conteúdo de amido e parede celular, fornecendo uma imagem mais detalhada dos produtos de armazenamento de energia dentro da célula. Os métodos aqui descritos permitiram novas descobertas no campo dos biocombustíveis algel e do tratamento de águas residuais.

Especificamente, este sistema tem sido usado para entender melhor como as bactérias influenciam o crescimento de algel.