Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

Ce protocole fournit des instructions pour la construction et l’utilisation d’un système photobioréacteur bubble column pour cultiver des microalgues, et devrait intéresser toute personne étudiant les biocarburants algel, le traitement des eaux usées, ou la biologie algel. Nous avons trouvé le système de réacteur de flèche pour produire des résultats très honorables. Le système de réacteur est également personnalisable à un large rang d’algues et coûte beaucoup moins cher que de nombreuses offres commerciales.

Qichen Wang, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer la configuration des photobioréacteurs bubble column, construisez un ensemble de couvercles ventilés à partir des couvercles en plastique des bouteilles en verre d’un litre et des tubes d’hybridation tels que décrits dans le protocole texte. Glissez un anneau O de 1/4 de pouce sur les bandes de roulement d’un raccord de leurre de montage de panneau de 1/8e pouce, et glissez ceci dans le trou de 1/4 de pouce percé dans le couvercle.

Glissez un deuxième 1/4 pouce sur les fils de sorte que le couvercle est pris en sandwich entre les deux anneaux O. Puis glissez un écrou de verrouillage sur les fils et serrez-le pour fixer le leurre de montage de panneau en place. Maintenant, snap pour verrouiller les anneaux sur le leurre mâle exposé, projetant à partir du couvercle.

Répétez cette procédure pour chaque trou dans le couvercle. Pour les couvercles qui seront utilisés sur la colonne à bulles et les réacteurs à bouteille, fixez le leurre femelle de 1/8e pouce aux raccords de barbe à des morceaux de 1 1/2 pouce de tube en PVC ID de 1/8e pouce. Attachez-les à chacun des raccords de leurre masculins exposés sur le couvercle.

Connectez une vanne de contrôle à l’extrémité libre de l’un des morceaux de 1/8e pouce. Connectez ensuite un leurre mâle à l’ajustement de barbe au deuxième morceau de tube de 1/8ème pouce projetant du couvercle. Cliquez sur l’anneau de verrouillage rotatif en place et attachez un filtre à air de 0,2 micron à cela.

Compleat assemblage du système de livraison d’air, réservoirs de poissons, plaques de remue-remuer, et les lumières comme décrié le protocole de texte. Concentrez le stock de microalgues réglés en enlevant le supernatent à l’aide d’une pompe à vide. Laissez moins de 100 millilitres de milieu dans chaque bouteille, mais évitez d’enlever les algues sédentaires.

Suspendre et transférer le lisier d’algues dans des tubes stériles de centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifugeuse 1000 fois G pendant cinq minutes pour concentrer davantage les algues. Dans l’armoire de biosécurité, enlever suffisamment supernatent pour atteindre un volume total d’environ 80 millilitres de concentrés d’algues pour 12 photobioréacteurs.

Évitez d’aspirer la pastille. Transférer le concentré d’algues dans un contenant de stérilisation. Maintenant, ajoutez six millilitres de boue d’algues dans chaque photobioréacteur avec une pipette sérologique de stérilisation de 10 millilitres.

Faites tourbillonner les bioréacteurs pour mélanger les algues dans le milieu. Tirez un échantillon de deux millilitres de chaque bioréacteur à l’aide d’une pipette sérologique et transférez-le dans un tube de deux millilitres. Recueillir un échantillon de deux millilitres toutes les 24 heures pour suivre l’évolution de la culture.

Vérifiez l’échantillon pour le ph à l’aide de bandes d’essai et ajustez le réacteur au besoin. Serrer les couvercles du bioréacteur et placer tous les bioréacteurs dans le bain d’eau du réservoir à poissons. Ajustez l’aération, le dioxyde de carbone et l’éclairage aux niveaux appropriés pour l’espèce.

Faites pivoter la position du bioréacteur chaque jour après l’échantillonnage. Appliquer 200 microlitres de chaque échantillon de culture en triplicate sur des puits d’une microplaque de 96 puits. Mesurez ensuite la densité optique à 550 nanomètres et 680 nanomètres.

Mesurer un volume fixe de culture d’algues à partir de chaque bioréacteur à l’aide d’un cylindre gradué et transférer dans des bouteilles de centrifugeuses. Centrifuger la culture 4 696 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatent en l’aspirant soigneusement dehors.

Transférer les granulés dans des tubes étiquetés de 50 millilitres. Rincer les bouteilles de centrifugeuse à l’eau distillée et transférer le contenu dans les tubes de 50 millilitres. Assurez-vous que le volume total ne dépasse pas 45 millilitres.

Après avoir lavé les granulés d’algues tels que décrits dans le protocole de texte, jetez le supernatent. Ajouter ensuite 7,5 millilitres d’eau distillée à chaque tube de 50 millilitres. Maintenant, vortex les tubes de 50 millilitres et transférer les boues d’algues dans des tubes pré-pesés de 15 millilitres.

Rincez les tubes de 50 millilitres avec de l’eau distillée supplémentaire et transférez le liquide dans les tubes de 15 millilitres en gardant le volume total de ces tubes à moins de 12 millilitres. Après avoir centrifugé les tubes de 15 millilitres et jeté le supernatent comme avant, congeler les tubes avec des granulés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes en prévision du gel du séchage. Ajouter 1,5 millilitres de solvant folique à chaque tube de deux millilitres contenant 20 milligrammes d’algues lyophilisés.

Verser environ 0,5 millilitres de perles de silice zirconia dans chaque tube jusqu’à ce que le niveau de liquide atteigne deux millilitres. Homogénéiser les échantillons d’algues dans un moulin à perles pendant 20 secondes à une vitesse de 6,5 mètres par seconde. Transférer les tubes sur les glaces pendant 30 secondes pour refroidir les échantillons.

Ensuite, répétez cinq fois de plus pour extraire complètement les lipides. Filtrer l’homogénéité à travers une seringue de cinq millilitres contenant un disque de maille métallique en acier inoxydable pour filtrer les perles, en recueillant le filtrate dans un tube de 15 millilitres. Laver les perles avec 1,5 millilitres de solvant folique, en poussant le liquide à travers avec la seringue si nécessaire.

Répétez ce lavage 2 fois de plus et recueillez tout le filtrate dans le tube de 15 millilitres, ce qui donne un volume final d’environ six millilitres. Ajouter 1,2 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,9 % à l’extrait de folque dans le tube de 15 millilitres et le vortex pour bien mélanger. Centrifugeuse les tubes de 15 millilitres à 6000 fois G pendant cinq minutes.

Enregistrez le volume de phase de chloroforme inférieur au millilitre le plus proche à l’aide de lignes sur le côté du tube de 15 millilitres. Ensuite, transférez la phase inférieure à une vile de verre à l’aide d’une pipette de pâturage en verre. Pour effectuer l’analyse lipidique neutre, diluer les extraits lipidiques et l’huile végétale standard trois fois avec du méthanol.

Pour chaque microplaque diluée, ajouter 80 microlitres à une microplaque de polypropylène de 96 puits en quadruplicate. Pour le solvant blanc, appliquer 80 microlitres de solvant folique dans le quadruplicate. Pour les normes, ajouter 10, 30, 60, 90 et 120 microlitres de la norme d’huile végétale diluée également en quadruplicate.

Placez la microplaque dans le capot de fumée sur un chauffe-bloc sec préchauffé à 55 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes jusqu’à ce que tout solvant se soit évaporé. Retirer la microplaque du bloc chauffant et laisser refroidir à température ambiante. Ensuite, ajouter 30 microlitres d’alcool isopropylique à chaque puits et mélanger en pipetting de haut en bas.

Assurez-vous que tous les canaux pipette mélangent la solution et dépensent les lipides, ce qui donne un liquide vert homogène. Maintenant, ajoutez 200 microlitres d’un microgramme par millilitre une solution rouge nil à chaque puits, et pipe de haut en bas 10 fois pour mélanger. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, ajouter 20 microlitres de solution d’eau de Javel à chaque puits, et le pipe de haut en bas cinq fois pour bien mélanger.

Laisser incuber le plat pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, lire la florescence dans les échantillons toutes les cinq à 10 minutes à 530 nanomètres excitation, émission de 575 nanomètres, avec des coupures automatiques réglées à 570 nanomètres jusqu’à ce que le signal des échantillons d’algues se stabilise. Cette procédure donne un cours du temps des données de densité optique algel à OD 550 nanomètres.

Les cultures témoins ont été cultivées sur un milieu NH4 ané frais. Le traitement un, est co-cultures auxenochlorella protothecoides et azospirillum brasiliense cultivés sur nh4 moyen frais inné. Le traitement deux, est un A.Protothecoides azinic cultivé sur le milieu inné de NH4 complété avec 50 milligrammes par millilitre IAA, qui a complètement inhibé la croissance d’algues.

Traitement trois, est azinique A.Protothecoides, cultivé sur le milieu dépensé de A.Brasilienes. Les courbes de croissance montrent que les cultures de protothécoides auxenochlorella entrent dans la croissance logarithmique tardive à 120 heures. On y voit des courbes de corelation entre la densité optique à 550 nanomètres et la concentration finale de poids sec, à l’aide d’un ajustement polynomial de second ordre.

Enfin, la coloration peut être appliquée aux données de densité optique du cours du temps pour obtenir une courbe de croissance du poids sec. Les mêmes traitements sont utilisés ici, sauf que la chlorella sorokiniana est cultivé au lieu de protothécoides auxenochlorella. Le lipide neutre de poids sec de pourcentage obtenu dans l’essai neutre de lipide corréle bien avec la teneur en glycérol de triose sur une plaque de chromatographie mince correspondante de couche.

Contrairement aux A.Protothecoides, le traitement de l’IAA n’a pas inhibé la croissance de C.Sorkiniana. Après l’extraction lipidique des algues, la palette cellulaire restante peut être analysée pour sa teneur en amidon et par paroi cellulaire, fournissant une image plus détaillée des produits de stockage d’énergie à l’intérieur de la cellule. Les méthodes décrites ici ont permis de nouvelles découvertes dans le domaine des biocarburants algel et du traitement des eaux usées.

Plus précisément, ce système a été utilisé pour mieux comprendre comment les bactéries influencent la croissance de l’algel.