Wir haben vor kurzem festgestellt, dass viele B-Zellen in LCK GFP Zebrafischen niedrige GFP-Werte ausdrücken. Dies macht diese Linie zu einem nützlichen Werkzeug für die Untersuchung von B-Zellen sowie T-Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir jetzt B-Zellen und T-Zellen von LCK GFP Zebrafischen oder wir können B-ALL und T-ALL-Zellen von Fischen mit Krebs untersuchen.
Diese Methoden ermöglichen die Entwicklung von B-Zellen und B-ALL-Studien bei Zebrafischen. Welche sind relevant für das Verständnis des adaptiven Immunsystems und es ist bösartig bei Kinderkrebs häufig. Wenn Sie noch nie diese Abschnitte durchgeführt haben, bevor Sie Ihre Technik ein paar Mal verfeinern möchten, bis Sie gute Thymus- und Markproben erhalten können.
Visuelle Demonstration wird den Betrachtern helfen, Fluor und B-ALL in Fischen zu erkennen und die richtigen Einstellungen für die Unterscheidung von B- und T-Zellen für ihre Isolierung auszuwählen. Nach der Anästhesisierung mit 0,02%Tricain im Fischsystemwasser verwenden Sie den GFP-Filter auf einem Epifluoreszenzmikroskop, um zwei bis sechs Monate alte Zebrafische auf fluoreszierenden Thymi am dorsalen medialen Aspekt der Zweighöhle zu untersuchen. Nachdem Sie den Thymus-Platz eingeschläferten Fisch in einer Petrischale lokalisiert haben, und verwenden Sie das Fluoreszenzmikroskop, um den GFP-positiven Thymi zu entfernen.
Und Hellfeldmikroskopie Einstellungen, um das Nierenmark und Milz zu ernten. Legen Sie jedes gesammelte Organ in eine 1,5-Milliliter-Röhre mit 500 Mikroliter kaltem Sortiermedium und verwenden Sie einen Stößel-Mikrorohr-Homogenisator, um das Gewebe auf Eis zu homogenisieren. Dann sfordern Sie das homogenisierte Gewebe durch einen 35-Mikrometer-Netzfilter, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen und die Zellen auf Eis zu legen.
Ab zwei bis vier Monaten verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um doppeltransgene Rag2:hMYC LCK EGFP-Fische mit niedrigen Expositionseinstellungen zu untersuchen, um helle akute lymphoblastische Leukämie oder T-ALL-Spezifische T-Zellen zu identifizieren, und Einstellungen mit hoher Exposition, um schwache B-ALL-Tiere zu identifizieren. Wildtypkontrolle und vorleukämische Fische haben GFP nur im Thymus lokalisiert. Kategorisieren Sie die Fische basierend auf dem Ausmaß der GFP-Fluoreszenz mit einem einfachen Drei-Kategorie-System.
Fische der Stufe eins zeigen ein fluoreszierendes Signal als thymischen Tumor mit nur begrenzter lokaler Ausbreitung. Fische der Stufe zwei zeigen ein fluoreszierendes Signal jenseits des Thymus, das weniger als 50 % des Körpers betrifft. Und Fische der Stufe 3 zeigen ein fluoreszierendes Signal, das über 50 % des Körpers hinausgeht.
Trennen Sie den Fisch mit ALLE von denen ohne Krebs. Und überwachen Sie die präleukämischen Fische ohne GFP-positive Tumoren einmal monatlich für die Entwicklung von neuen ALL. Für T oder B-ALL Zellisolierung verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Kopf und thymische Bereich eines eingeschläferten Fisches der Stufe 3 zu entfernen und den Körper in eine Petrischale zu legen.
Verwenden Sie eine P-1000 Pipette, um die Peritonealhöhle des Fisches mit 500 Mikroliterkaltem Sortiermedium zu waschen und die Zellen und das Medium in einem Fünf-Milliliter-Rohr zu sammeln. Mit einer frischen Pipettenspitze zwei bis drei zusätzliche 200 bis 300 Mikroliter Volumen kalten Sortiermediumin in die Körperhöhle injizieren und mit der Spitze der Pipette sanften Druck auf den Fischkörper ausüben, um die Zellen aus der Körperhöhle in das Fünf-Milliliter-Rohr zu extrudieren. Dann die Zellsuspension durch einen 35-Mikroliter-Netzfilter abseihen.
Und legen Sie die Zellen auf Eis bis zu ihrer Analyse durch Durchflusszytometrie. Für die Ganzkörperhomogenisierung verwenden Sie einen Stößel-Mikrorohr-Homogenisator, um den Körper der Fische zu homogenisieren und weitere 300 Mikroliter kalter Sortiermedium in das Rohr einzutragen. Filtern Sie die Zellsuspension durch einen 35-Mikrometer-Netzfilter und waschen Sie den Filter bei Bedarf mit zusätzlichem Sortiermedium, bis nur noch Gewebeablagerungen auf dem Filter verbleiben.
Legen Sie dann die Zellen bis zu ihrer Analyse auf Eis. Für die zytometrische Durchflussanalyse der isolierten Zellen werden die Durchflusszytometerparameter gemäß den Herstellerrichtlinien festgelegt. Und erwerben 10.000 bis 50.000 Ereignisse, um die vorderen Streu- und Seitenstreuungsparameter für die Definition der Lymphozyten- und Vorläuferzelltore festzulegen und die zellulären Trümmer auszuschließen.
Schließen Sie die Zelldoublets aus und verwenden Sie die Lymph- und/oder Vorläufertore, um die Anzahl und den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen zu bestimmen. Mit Phycoerythrin und die GFP-Intensitäten definieren Tore für die GFP negativ im Vergleich GFP niedrig im Vergleich GFP hohe Zellen. Zu lernen, wo die Tore für die Isolierung der GFP-niedrigen und GFP-hochzellige Zellen zu platzieren, ist entscheidend, um reine B- und T-Zellpopulationen zu erhalten.
Aus dem Thymus können zwei unterschiedliche GFP-positive Populationen, GFP-niedrige B-Zellen und GFP-Hoch-T-Zellen gewonnen werden. B-Zellen, die im Nierenmark von drei Monate alten Zebrafischen leben, drücken niedrige GFP-Werte aus. GFP-hohe Zellen sind jedoch knapp, was darauf hindeutet, dass nur ein kleiner Prozentsatz der T-Lymphozyten im Alter von drei Monaten im Mark vorhanden ist.
Ebenso zeigen Splenic-Proben höhere GFP-Prozentsätze als GFP-hochzellige Zellen. Bei doppeltransgenen Fischen, die noch keine akute lymphoblastische Leukämie entwickelt haben, ist die GFP-Expression im Thymus, Mark und Milz ähnlich wie bei eintransgenen LCK-EGFP-Fischen. Jedoch, die Anzahl der Lymphozyten pro Organ ist erhöht.
Vermutlich aufgrund der MYC-getriebenen Expansion unreifer B- und T-Zellpopulationen, in denen der rag2-Promotor aktiv ist. Bei doppeltransgenen Fischen mit B und T-ALL, die bis zu sechs Monaten fluoreszierende Krebsarten entwickelt haben, sind B-ALL schwach fluoreszierende Krebsarten, die überwiegend GFP-arme Zellen enthalten. Im Gegensatz dazu können hell fluoreszierende Fische entweder isolierte T-ALL- oder gemischte Populationen von GFP-low B-ALL- und GFP-hoch T-ALL-Zellen beherbergen.
Tatsächlich exprimieren gfK niedrige Zellen, wie die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse untersucht, höhere Konzentrationen von B-Zell-Transkripten. Und GFP-Hochzellen exprimieren höhere Konzentrationen von T-Zellgenen, LCK und dem GFP-Marker. Es ist wichtig zu lernen, wie man Fische mit B-ALL durch Mikroskopie erkennt.
Und wie man die Durchflusszytometrie-Gates richtig definiert, um GFP-niedrige und GFP-hohe Populationen zu trennen. Nach diesem Verfahren können Sie DNA, RNA oder Protein aus GFP-niedrigen und GFP-hochbildenden Zellen für PCR, Sequenzierung, Blut- oder In-vivo-Transplantationsexperimente isolieren. Sobald wir gelernt haben, dass LCK GFB-Fische zusätzlich zu T-Zellen fluoreszierende B-Zellen haben, konnten wir beide Zelltypen desselben Tieres untersuchen, um B und T-ALL zu bewerten.
