وجدنا مؤخرا أن العديد من الخلايا B في LCK GFP الحمار الوحشي التعبير عن مستويات منخفضة من GFP. وهذا يجعل هذا الخط أداة مفيدة لدراسة الخلايا B وكذلك الخلايا التائية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه الآن يمكننا دراسة الخلايا B والخلايا التائية من LCK GFP حمار وحشي أو يمكننا دراسة B-ALL و T-ALL الخلايا من الأسماك المصابة بالسرطان.
هذه الأساليب تمكين تطوير الخلية B والدراسات B-ALL في حمار وحشي. وهي ذات صلة بفهم الجهاز المناعي التكيفي وانها الأورام الخبيثة الشائعة في سرطان الأطفال. إذا كنت قد فعلت أبدا هذه التشريح قبل قد ترغب في صقل الأسلوب الخاص بك عدة مرات حتى يمكنك الحصول على عينات الغدة الصعترية والنخاع جيدة.
سوف مظاهرة بصرية تساعد المشاهدين على التعرف على الفلوروس وB-ALL في الأسماك واختيار الإعدادات الصحيحة للتمييز B و T الخلايا لعزلها. بعد تخدير مع 0.02٪ Tricaine في المياه نظام الأسماك استخدام مرشح GFP على مجهر epifluorescence لفحص حمار وحشي من العمر شهرين إلى ستة أشهر للثمي الفلورسنت في الجانب الوسيط الظهري من التجويف الفرعى. بعد تحديد مكان الغدة الصعترية مكان الأسماك القتل الرحيم في طبق بيتري واستخدام المجهر الفلورسنت لإزالة الزعتري إيجابية GFP.
وإعدادات المجهر في الملعب المشرق لحصاد نخاع الكلى والطحال. ضع كل عضو تم جمعه في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولترات من وسيط الفرز البارد واستخدم مُتجانسات الأنابيب الدقيقة المُتَمَرِّسة لتجانس الأنسجة على الجليد. ثم، سلالة الأنسجة المتجانسة من خلال مرشح شبكة 35 ميكرومتر لتوليد تعليق خلية واحدة ووضع الخلايا على الجليد.
ابتداء من شهرين إلى أربعة أشهر استخدام المجهر الفلورسنت لفحص مزدوجة المعدلة وراثيا rag2: hMYC LCK EGFP الأسماك باستخدام إعدادات التعرض المنخفض لتحديد الخلايا التائية مشرق سرطان الدم الليمفاوي الحاد أو T-ALL وارتفاع إعدادات التعرض لتحديد قاتمة B-ALL الحيوانات. التحكم في النوع البري والأسماك قبل اللوكيميا قد GFP موضعية فقط في الغدة الصعترية. تصنيف الأسماك على أساس مدى الفلورية GFP باستخدام نظام فئة ثلاثة بسيطة.
مستوى واحد الأسماك تظهر إشارة الفلورسنت ورم زعتر مع انتشار محلي محدود فقط. مستوى اثنين من الأسماك تظهر إشارة الفلورسنت وراء الغدة الصعترية التي تنطوي على أقل من 50٪ من الجسم. والمستوى الثالث من الأسماك يدل على إشارة الفلورسنت تمتد إلى ما بعد 50٪ من الجسم.
فصل الأسماك مع ALL من تلك التي لا السرطان. ورصد الأسماك قبل اللوكيميا دون أورام إيجابية GFP مرة واحدة شهريا لتطوير ALL جديدة. لتي أو B-ALL خلية العزل استخدام شفرة حلاقة لإزالة الرأس والزعتر المنطقة من الأسماك من المستوى الثالث القتل الرحيم ووضع الجسم في طبق بتري.
استخدام ماصة P-1000 لغسل تجويف صيدني السمك مع 500 ميكرولترات من متوسطة الفرز الباردة، وجمع الخلايا والمتوسطة في أنبوب خمسة ملليلتر. باستخدام طرف ماصة جديدة حقن اثنين إلى ثلاثة إضافية 200 إلى 300 microliter حجم من متوسطة الفرز الباردة في تجويف الجسم واستخدام غيض من ماصة لتطبيق ضغط لطيف على الجسم السمك لقذف الخلايا من تجويف الجسم في أنبوب المليلتر الخمسة. ثم، سلالة تعليق الخلية من خلال مرشح شبكة ميكروليتر 35.
ووضع الخلايا على الجليد حتى تحليلها عن طريق تدفق الخلايا. التجانس الجسم كله استخدام المجسّد microtube الآفات لتجانس الجسم من الأسماك وإضافة 300 ميكرولترات إضافية من وسط الفرز البارد إلى الأنبوب. تصفية تعليق الخلية من خلال مرشح شبكة ميكرومتر 35، وغسل المرشح مع متوسطة فرز إضافية حسب الضرورة حتى يبقى فقط الحطام الأنسجة على المرشح.
ثم ضع الخلايا على الجليد حتى تحليلها. لتحليل تدفق الخلايا السيتومية من الخلايا المعزولة تعيين المعلمات تدفق مقياس الخلايا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. والحصول على 10، 000 إلى 50، 000 الأحداث لتعيين المعلمات مبعثر الجانب وتشتت للأمام لتحديد الخلايا الليمفاوية وبوابات الخلية السلف واستبعاد الحطام الخلوي.
استبعاد مزدوجة الخلية واستخدام البوابات اللمفاوية و / أو السلائف لتحديد عدد ونسبة من الخلايا الإيجابية GFP. استخدام فيكويريثرين وكثافات GFP تحديد بوابات لGFP السلبية مقابل GFP منخفضة مقابل GFP الخلايا العالية. إن تعلم مكان وضع البوابات لعزل الخلايا العالية GFP المنخفضة والخلايا العالية GFP أمر بالغ الأهمية للحصول على مجموعات الخلايا B و T النقية.
ويمكن الحصول على اثنين من السكان إيجابية واضح GFP، GFP الخلايا B منخفضة والخلايا T GFP عالية من الغدة الصعترية. B الخلايا التي تعيش في نخاع الكلى من ثلاثة أشهر من العمر حمار وحشي التعبير عن مستويات منخفضة من GFP. ومع ذلك، فإن الخلايا العالية من نوع GFP نادرة، مما يشير إلى أن نسبة ضئيلة فقط من الخلايا اللمفاوية التائية موجودة في النخاع في عمر ثلاثة أشهر.
وبالمثل، تظهر عينات الزبلين نسباً أعلى من GFP منخفضة من الخلايا العالية GFP. في الأسماك مزدوجة المعدلة وراثيا التي لم تتطور بعد سرطان الدم الليمفاوي الحاد، تعبير GFP في الغدة الصعترية والنخاع والطحال مماثلة لتلك التي لوحظت في واحد المعدلة وراثيا LCK EGFP الأسماك. ومع ذلك، يتم زيادة أعداد الخلايا الليمفاوية لكل عضو.
من المفترض ، بسبب MYC مدفوعة التوسع في مجموعات الخلايا غير ناضجة B و T التي rag2 المروج نشطة. في الأسماك مزدوجة المعدلة وراثيا مع B و T-ALL التي وضعت سرطانات الفلورسنت من قبل ستة أشهر B-ALL هي سرطانات الفلورسنت خافت تحتوي على خلايا منخفضة GFP في الغالب. وعلى النقيض من ذلك، يمكن أن تؤوي الأسماك الفلورية الزاهية إما مجموعات T-ALL المعزولة أو مجموعات مختلطة من كل من الخلايا B-ALL المنخفضة من GFP والخلايا T-ALL العالية.
في الواقع، كما هو مقدر من قبل تحليل تفاعل البوليميراز سلسلة كمية GFP منخفضة تعبر عن مستويات أعلى من سجلات الخلية B. والخلايا العالية GFP التعبير عن مستويات أعلى من الجينات الخلية T، LCK وعلامة GFP. من المهم للغاية معرفة كيفية التعرف على الأسماك باستخدام B-ALL عن طريق المجهر.
وكيفية تحديد بشكل صحيح البوابات تدفق قياس الاستئصالي لفصل GFP منخفضة وSFP السكان عالية. بعد هذا الإجراء، يمكنك عزل الحمض النووي، RNA، أو البروتين من GFP منخفضة وGFP الخلايا العالية لPCR، والتسلسل، ما هو في الدم أو في تجارب زرع الجسم الحي. مرة واحدة تعلمنا LCK GFB الأسماك والخلايا الفلورسنت B بالإضافة إلى الخلايا التائية يمكننا دراسة كل أنواع الخلايا من نفس الحيوان لتقييم B و T-ALL.
