Недавно мы обнаружили, что многие B-клетки в LCK GFP зебры выражают низкий уровень GFP. Это делает эту линию полезным инструментом для изучения В-клеток, а также Т-клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что теперь мы можем изучать В-клетки и Т-клетки из LCK GFP зебры или мы можем изучать B-ALL и T-ALL клеток от рыбы с раком.
Эти методы позволяют B-клеток развития и B-ALL исследований в зебры. Которые имеют отношение к пониманию адаптивной иммунной системы, и это злокачественные новообразования распространены в педиатрическом раке. Если вы никогда не делали эти вскрытия, прежде чем вы, возможно, пожелает уточнить вашу технику несколько раз, пока вы не можете получить хорошие образцы тимуса и костного мозга.
Визуальная демонстрация поможет зрителям распознать фтор и B-ALL у рыб и выбрать правильные настройки для распознавания В и Т-клеток для их изоляции. После анестезии с 0,02% Tricaine в рыбной системе воды использовать фильтр GFP на эпифлюоресценции микроскопа для изучения двух-шести месяцев зебры для флуоресцентных тими на спинной медиальный аспект ветвистой полости. После обнаружения тимуса место усыпляемой рыбы в чашке Петри и использовать флуоресцентный микроскоп, чтобы удалить GFP положительный тими.
И брайтфилд микроскопии настройки для сбора костного мозга и селезенки. Поместите каждый собранный орган в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 500 микролитров холодного сортирования среды и используйте гомогенизатор pestle microtube для гомогенизации тканей на льду. Затем процедите гомогенизированную ткань через 35-метровый сетчатый фильтр для генерации одноклеточной подвески и поместите клетки на лед.
Начиная с двух-четырех месяцев использовать флуоресцентный микроскоп для проверки двойной трансгенной тряпкой2:hMYC LCK EGFP рыбы с использованием низких настроек воздействия для выявления ярких Т-клеток острого лимфобластного лейкоза или T-ALL и высокой экспозиции настройки для выявления тусклый B-ALL животных. Дикий тип контроля и до-лейкемии рыбы GFP локализованы только в тимусе. Категоризация рыбы на основе степени флуоресценции GFP с помощью простой системы из трех категорий.
Рыба одного уровня демонстрирует флуоресцентный сигнал как тимическая опухоль с ограниченным местным распространением. Рыбы 2-го уровня демонстрируют флуоресцентный сигнал за пределами тимуса с участием менее 50% тела. И 3-й уровень рыбы демонстрируют флуоресцентный сигнал, простирающийся за пределы 50% тела.
Отделить рыбу со ВСЕМИ от тех, кто без рака. И контролировать до-лейкемических рыб без GFP положительных опухолей один раз в месяц для развития новых ВСЕХ. Для изоляции клеток T или B-ALL используйте лезвие бритвы для удаления головы и тимической области усыпанной рыбы третьего уровня и поместите тело в чашку Петри.
Используйте P-1000 пипетки для мытья рыбы брюшной полости с 500 микролитров холодного сортировки среды, собирая клетки и среды в пяти миллилитровой трубки. Использование свежей наконечник пипетки впрыскивают два-три дополнительных 200 до 300 микролитров объемов холодной сортировки среды в полость тела и использовать кончик пипетки применять мягкое давление на организм рыбы, чтобы выдавить клетки из полости тела в пятими миллилитровую трубку. Затем процедите подвеску клетки через фильтр сетки из 35 микролитров.
И поместите клетки на лед до их анализа по цитометрии потока. Для всего тела гомогенизации использовать pestle микротрубки гомогенизатор гомогенизации тела рыбы и добавить дополнительные 300 микролитров холодной сортировки среды в трубку. Фильтровать подвеску клетки через 35-метровый фильтр сетки, мыть фильтр с дополнительной сортировки среды по мере необходимости, пока только ткани мусора остается на фильтре.
Затем поместите клетки на лед до их анализа. Для цитометрического анализа потока изолированных клеток устанавливаются параметры цитометра потока в соответствии с руководящими принципами производителя. И приобретите от 10 000 до 50 000 событий, чтобы установить параметры рассеяния вперед и боковых рассеяний для определения лимфоцитов и ворот клеток-предшественников и исключить клеточный мусор.
Исключите дублеты клеток и используйте лимфоидные и/или ворота прекурсоров для определения количества и процента положительных клеток GFP. Использование фикоэритрона и интенсивности GFP определяют ворота для отрицательного GFP по сравнению с низким GFP по сравнению с высокими ячейками GFP. Обучение, где разместить ворота для изоляции GFP низких и GFP высоких клеток имеет решающее значение для получения чистой популяции B и Т-клеток.
Два различных GFP положительные популяции, GFP низких В-клеток и GFP высоких Т-клеток могут быть получены из тимуса. В-клетки, проживающие в костном мозге трехмесячной зебры, выражают низкий уровень GFP. GFP высоких клеток не хватает, однако, что свидетельствует о том, что лишь небольшой процент Т-лимфоцитов присутствуют в костном мозге в три месяца.
Аналогичным образом, splenic образцы показывают более высокий процент GFP низким, чем GFP высоких клеток. У двух трансгенных рыб, у которой еще не развился острый лимфобластный лейкоз, экспрессия GFP в тимусе, костном мозге и селезенке аналогична выражению, наблюдаемому у однопергенной рыбы LCK EGFP. Тем не менее, количество лимфоцитов на орган увеличивается.
Предположительно, из-за MYC обусловлено расширение незрелых B и Т-клеток популяций, в которых rag2 промоутер активен. В двойной трансгенной рыбы с B и или T-ALL, которые разработали флуоресцентные раковые заболевания на шесть месяцев B-ALL являются тускло флуоресцентных раковых заболеваний, содержащих в основном GFP низких клеток. В отличие от этого, ярко флуоресцентные рыбы могут гавани либо изолированных T-ALL или смешанных популяций как GFP низким B-ALL и GFP высоких Т-ALL клеток.
Действительно, по оценке количественного анализа полимеразной цепной реакции GFP низкие клетки выражают более высокие уровни В-клеточных транскриптов. И GFP высокие клетки выражают более высокие уровни генов Т-клеток, LCK и маркер GFP. Очень важно научиться распознавать рыбу с помощью B-ALL с помощью микроскопии.
И как правильно определить поток цитометрии ворота для разделения GFP низких и GFP высоких популяций. Следуя этой процедуре, вы можете изолировать ДНК, РНК или белок от GFP низких и GFP высоких клеток для ПЦР, секвенирования, что в крови или виво трансплантации экспериментов. Как только мы узнали LCK GFB рыбы имеют флуоресцентные В-клетки в дополнение к Т-клеток мы могли бы изучить оба типа клеток из одного и того же животного для оценки B и T-ALL.
