לירות meristems apical לשלוט צמיחת הצמח ורבייה. שיטה זו מסייעת לנו לחקור את המורפולוגיה והמבנים הפנימיים של ירי מריסטמים אפיים לא רק במין המודל אלא גם בגידולים שונים. טכניקה זו היא הליך יעיל מאוד.
לירות meristem apical ניתן לדמיין ישירות ברזולוציה תאית גבוהה ללא כל קיבעון מדגם עתיר עבודה וצעדי חתך רקמות. ראשית, לגדל ערביידופסיס, עגבניות, וצמחי סויה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. חותכים את תפרחת לירות איפקס מצמחי Arabidopsis מוברגים.
החזיקו את החלק הבסיסי של הגבעול הראשי, ולהשתמש במקלות כדי להסיר כמה שיותר איברי פרחים ישנים ככל האפשר מהגזע הראשי. המשך להסיר את שאר הפרחים בשדה של מיקרוסקופ סטריאו עד meristem apical לירות ניתן לראות מן העיניים. כדי לצפות בצמחייה לירות meristems apical מעגבניות או סויה, לנתח את הקוטילדונים, עלים, ושורשים מן הצמח.
החזיקו את ההיפוקוטילים של הצמח מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, ולהשתמש במטסים כדי לנתח עוד יותר את העלים ואת פרימורדיית העלים המכסים את הריסתם הצמחית. פיפט 50 מיקרוליטרים של תותח פרופידיום יודיד בצלחת פטרי נקייה וריקה. טובלים את כל איפקס היורה המנותק לצבע במשך שתי דקות.
במהלך תהליך הכתמים, לטבול את כל תפרחת לירות meristem אפית או וגטטיבי לירות meristem אפית לתוך פתרון יודיד פרופיד כדי להשיג כתמים אחידים. שוטפים את איפקס הירי המוכתם פעמיים במים סטריליים, דה-מיונים. עכשיו, לנקב חור במרכז צלחת הדמיה מוכנה באמצעות מדפים, ולתקוע את היורה מוכתם זקוף במדיום.
ממלאים את צלחת ההדמיה במים סטריליים, deionized לטבול לחלוטין את המדגם. הצג את הדגימה דרך מיקרוסקופ הסטריאו. פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר לכודות סביב מריסטם.
לאחר מכן, להתאים את הזווית של הגבעול ב agar כדי לוודא כי meristem apical לירות גלוי לחלוטין מלמעלה. עכשיו, מניחים את צלחת ההדמיה על שלב הדגימה של מיקרוסקופ הקונפוקל. מנמיך את עדשת טבילת המים, ומרים את שלב דגימת המיקרוסקופ כדי לאפשר לקצה העדשה לטבול במים.
פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי, ולהשתמש ב eyepieces כדי לאתר ולהתמקד meristem apical לירות בשדה הבהיר. הפעילו את פונקציית הרכישה בתוכנת המיקרוסקופ הקונפוקל. הפעל את המצב החי כדי להציג את הדגימה ממסך המחשב והגדר את כל הפרמטרים לניסוי סריקת הלייזר.
בעת התאמת הפרמטרים, השתמש בפונקציה מחוון טווח כדי להגדיר אם האות רווי או לא. אותה תוכנה ששימשה לרכישת דימות יכולה לשמש להדמיה של הקרנה שקופה תלת-ממדית. פתחו את קובץ הקונפוסל המקורי, לחצו על תפריט תלת-מימד ובחרו 'שקוף' ליצירת תצוגת הקרנה תלת-מימדית.
לחלופין, בחרו 'שקיפות' להתאמת שלושה פרמטרים של ההקרנה, כולל 'סף', 'שיפוע' ו'מקסימום' לשקיפות התמונה תלת-מימדית. כעת, בחרו 'אור' להתאמת הבהירות של התמונה תלת-מימדית. יצא את התמונות המוקרנות ושמור אותן כקבצי TIFF.
להצגה חזותית של תצוגת קידוד העומק של התמונות תלת-מימדיות, השתמש באותה תוכנה. שוב, לחצו על 'תלת-מימד' ובחרו 'מראה'. בחרו 'מיוחד' ובחרו 'קידוד עומק'.
יצא את התמונות המוקרנות ושמור אותן כקבצי TIFF. תמונה זו מן החלק orthogonal דרך אמצע Arabidopsis לירות מריסטם apical מראה כי הקירות האופקיים מוכתמים יודיד פרופיד כמעט בכל התאים בשכבות תאים מרובים. מבט על קטע רוחבי אחד דרך הקורפוס של תפרחת לירות מריסטם apical מראה כי התאים ממישור XY הם גם בתמונה ברורה.
תצוגת ההקרנה תלת מימדית מגלה כי מריסטם תפרחת יוצר מבנה דמוי כיפה ומוקף פרימורדיה הפרח המתפתחת. תמונה זו מן החלק orthogonal דרך אמצע העגבניות לירות מריסטם אפית גם מראה כי הקירות האופקיים מוכתמים יודיד פרופיד בשכבות תאים מרובים, אם כי אות יודיד פרופיד מאזור הפנים העמוק הוא מעט נמוך יותר. תמונה מקטע רוחבי אחד דרך השכבות העמוקות של מריסטם האף הצמחי חושפת את התאים ממטוסי ה- XY ואת הגבול שנוצר בין מריסטם הצמחי לפרימורדיית העלים.
תצוגת ההקרנה תלת מימדית יכולה לספק תצוגה מקיפה של הצורה והארגון של מריסטם הצמחי מעגבניות. מוצג כאן הוא נוף אורתוגונאלי דרך אמצע מריסטם פולי סויה לירות apical והקרנה 3D של מריסטם אפית לירות אותו. גם מריסטם הצמחי דמוי הכיפה ופרימורדיית העלים החדשים הנגזרים שלו ניתנים לצפייה.
Propidium יודיד יכול בקלות כתם תאים פגומים או מתים, אשר ישפיעו מאוד על איכות התמונות, ולכן חשוב למנוע כל נזק פיזי בעת הכנת לירות דגימות מריסטם apical.
