I meristemi apicici controllano la crescita e la riproduzione delle piante. Questo metodo ci aiuta a indagare la morfologia e le strutture interne dei meristemi apicali di germogli non solo nelle specie modello ma anche in diverse colture. Questa tecnica è una procedura molto efficiente.
Il meristem apicale shoot può essere visualizzato direttamente in un'alta risoluzione cellulare senza alcuna fissazione del campione ad alta intensità di lavoro e passaggi di sezionamento dei tessuti. Per iniziare, coltiva piante di Arabidopsis, pomodoro e soia come descritto nel protocollo di testo. Tagliare l'apice del germoglio di infiorescenza dalle piante di Arabidopsis imbullonato.
Tenere la parte basale del gambo principale e utilizzare le forcep per rimuovere il maggior numero possibile di organi floreali più vecchi dal gambo principale. Continuare a rimuovere il resto dei fiori nel campo del microscopio stereo fino a quando il meristem apicico shoot può essere visualizzato dagli oculari. Per visualizzare i meristemi apicale del germoglio vegetativo dal pomodoro o dalla soia, sezionare i cotiledoni, le foglie e le radici della pianta.
Tenere gli ipocotili della pianta al microscopio stereo e utilizzare le forcep per sezionare ulteriormente le foglie e la primordia fogliare che coprono i meristemi apicali del germoglio vegetativo. Pipetta 50 microlitri di soluzione di ioduro di propidio in una piastra di Petri pulita e vuota. Immergere l'intero apice del germoglio sezionato nella tintura per due minuti.
Durante il processo di colorazione, immergere l'intero meristem apico del germoglio di infiorescenza o nel meristem apicico del germoglio vegetativo nella soluzione di ioduro propidio per ottenere una colorazione uniforme. Risciacquare l'apice del germoglio macchiato due volte in acqua sterile e deionizzata. Ora, perforare un buco al centro di un piatto di imaging preparato usando le forcep e attaccare l'apice del germoglio macchiato in posizione verticale nel mezzo.
Riempire il piatto di imaging con acqua sterile e deionizzata per immergere completamente il campione. Visualizzare il campione attraverso il microscopio stereo. Pipetta su e giù per rimuovere le bolle d'aria intrappolate intorno al meristem.
Quindi, regolare l'angolo dello stelo nell'agar per assicurarsi che il meristem apicico di tiro sia completamente visibile dall'alto. Ora, posizionare la scheda di imaging sullo stadio campione del microscopio confocale. Abbassare l'obiettivo di immersione in acqua e sollevare lo stadio del campione del microscopio per lasciare che la punta dell'obiettivo si tuffi nell'acqua.
Aprire il software al microscopio confocale e utilizzare gli oculari per individuare e concentrarsi sul meristem apicico shoot nel campo luminoso. Utilizzare la funzione Acquisition nel software al microscopio confocale. Avviare la modalità live per visualizzare l'esempio dallo schermo del computer e impostare tutti i parametri per l'esperimento di scansione laser.
Quando si regolano i parametri, utilizzare la funzione Indicatore intervallo per definire se il segnale è saturo o meno. Lo stesso software utilizzato per l'acquisizione di immagini può essere utilizzato per visualizzare una proiezione trasparente tridimensionale. Aprite il file confocale originale, fate clic sul menu 3D e selezionate Trasparente (Transparent) per generare una vista di proiezione 3D.
Facoltativamente, selezionate Trasparenza (Transparency) per regolare tre parametri della proiezione, tra cui Soglia, Rampa e Massimo per la trasparenza dell'immagine 3D. Ora, selezionare Luce per regolare la luminosità dell'immagine 3D. Esportare le immagini proiettate e salvarle come file TIFF.
Per visualizzare la visualizzazione della codifica di profondità delle immagini 3D, utilizzare lo stesso software. Anche in questo caso, fare clic sul menu 3D e selezionare Aspetto. Selezionate Speciale (Special) e Codifica profondità (Depth Coding).
Esportare le immagini proiettate e salvarle come file TIFF. Questa immagine dalla sezione ortogonale attraverso il centro dell'Arabidopsis spara meristem apicale mostra che le pareti orizzontali sono macchiate di ioduro di propidio in quasi tutte le cellule a strati cellulari multipli. Una vista di una sezione trasversale attraverso il corpus dell'infiorescenza spara meristem apicale mostra che anche le cellule del piano XY sono chiaramente immagini.
La vista di proiezione 3D rivela che il meristem dell'infiorescenza forma una struttura a cupola ed è circondato dal primordia dei fiori in via di sviluppo. Questa immagine dalla sezione ortogonale attraverso il centro del meristem apicale del germoglio di pomodoro mostra anche che le pareti orizzontali sono macchiate di ioduro di propidio a più strati cellulari, sebbene il segnale di ioduro propidio dalla regione interna profonda sia leggermente inferiore. Un'immagine di una sezione trasversale attraverso gli strati profondi del meristem apicali di tiro vegetativo rivela le cellule dei piani XY e il confine formato tra il meristem vegetativo e il primordia fogliare.
La vista di proiezione 3D può inoltre fornire una visione completa della forma e dell'organizzazione del meristem vegetativo dal pomodoro. Qui è mostrata una vista ortogonale attraverso il mezzo del meristem apicale del germoglio di soia e una proiezione 3D dello stesso meristem apicale di ripresa. Sono osservabili anche il meristem vegetativo a cupola e la sua nuova primordia fogliare derivata.
Lo ioduro di propidio può facilmente macchiare le cellule danneggiate o morte, il che influenzerà notevolmente la qualità delle immagini, quindi è importante evitare qualsiasi danno fisico durante la preparazione di campioni meristem apicali.
