Apikal meristems kontrol bitki büyüme ve üreme vur. Bu yöntem, sadece model türlerde değil, aynı zamanda farklı bitkilerde de ateş apikal meristems morfolojisi ve iç yapıları araştırmak yardımcı olur. Bu teknik çok verimli bir işlemdir.
Shoot apikal meristem doğrudan herhangi bir emek yoğun örnek fiksasyon ve doku kesit adımları olmadan yüksek hücresel çözünürlükte görselleştirilmiş olabilir. Başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak Arabidopsis, domates ve soya bitkileri büyümek. Cıvatalı Arabidopsis bitkilerden çiçek çekim apeks kesin.
Ana sapbaz kısmını tutun ve ana kök mümkün olduğunca çok eski çiçek organları kaldırmak için forceps kullanın. Çekim apikal meristem gözlükgörülebilir kadar stereo mikroskop alanında çiçeklerin geri kalanını kaldırmaya devam edin. Bitkisel ateş apikal meristems ya domates veya soya fasulyesi görüntülemek için, cotyledons dışarı incelemek, yaprakları, ve bitkiden kökleri.
Stereo mikroskop altında bitkinin hipokotil tutun ve daha fazla vegetatif ateş apikal meristems kapsayan yaprak ve yaprak primordia dışarı incelemek için forseps kullanın. Pipet 50 mikrolitre propidium iyodür çözeltisi temiz ve boş petri kabında. İki dakika boyunca boya içine tüm diseksiyon ateş apeks daldırma.
Boyama işlemi sırasında, tüm çiçeklenme ateş apikal meristem veya vegetatif ateş apikal meristem propidium iyodür çözeltisi içine tek tip boyama elde etmek için batırın. Lekeli ateş apeksiki steril, deiyonize su durulayın. Şimdi, forseps kullanarak hazırlanmış bir görüntüleme çanak merkezinde bir delik delmek ve orta dik lekeli ateş apeks sopa.
Numuneyi tamamen batırmak için görüntüleme kabını steril, deiyonize suyla doldurun. Örneği stereo mikroskoptan görüntüleyin. Pipet yukarı ve aşağı meristem etrafında sıkışıp hava kabarcıkları kaldırmak için.
Daha sonra, ateş apikal meristem doğrudan yukarıdan tamamen görünür olduğundan emin olmak için agar kök açısını ayarlayın. Şimdi, görüntüleme kabını konfokal mikroskobunun örnek aşamasına yerleştirin. Su daldırma merceğini düşürün ve lensin ucunun suya düşmesini sağlamak için mikroskop örnek aşamasını yükseltin.
Konfokal mikroskop yazılımını açın ve parlak alanda çekim apikal meristem bulmak ve odaklanmak için gözlük kullanın. Confocal mikroskop yazılımında Edinme işlevini çalıştırın. Örneği bilgisayar ekranından görüntülemek için canlı modu başlatın ve lazer tarama deneyi için tüm parametreleri ayarlayın.
Parametreleri ayarlarken, sinyalin doymuş olup olmadığını tanımlamak için Aralık Göstergesi işlevini kullanın. Görüntüleme edinimi için kullanılan aynı yazılım, üç boyutlu saydam projeksiyonu görselleştirmek için kullanılabilir. Özgün confocal dosyasını açın, 3B menüsünü tıklatın ve 3B projeksiyon görünümü oluşturmak için Saydam'ı seçin.
İsteğe bağlı olarak, 3B görüntünün saydamlığı için Eşik, Rampa ve Maksimum dahil olmak üzere projeksiyonun üç parametresini ayarlamak için Saydamlık'ı seçin. Şimdi, 3B görüntünün parlaklığını ayarlamak için Işık'ı seçin. Yansıtılan görüntüleri dışa aktarın ve bunları TIFF dosyaları olarak kaydedin.
3B görüntülerin derinlik kodlama görünümünü görselleştirmek için aynı yazılımı kullanın. Yine, 3B menüsünü tıklatın ve Görünüm'u seçin. Özel'i seçin ve Derinlik Kodlama'yı seçin.
Yansıtılan görüntüleri dışa aktarın ve bunları TIFF dosyaları olarak kaydedin. Arabidopsis'in ortasına kadar ortogonal bölümden alınan bu görüntü, yatay duvarların birden fazla hücre katmanındaki hemen hemen tüm hücrelerde propidium iyodür ile boyandığını göstermektedir. Çiçek çekimi apikal meristem korpus aracılığıyla bir enine bölüm görünümü XY düzlemindeki hücrelerin de açıkça görüntülenmiş olduğunu göstermektedir.
3D projeksiyon görünümü çiçeklenme meristem kubbe gibi bir yapı oluşturur ve gelişmekte olan çiçek primordia ile çevrili olduğunu ortaya koymaktadır. Domates sürgün apikal meristem ortasından ortogonal bölümünden bu görüntü de yatay duvarlar propidium iyodür ile birden fazla hücre katmanlarında lekeli olduğunu gösterir, derin iç bölgeden propidium iyodür sinyali biraz daha düşük olmasına rağmen. Vegetatif ateş apikal meristem derin katmanları ile bir enine bölümden bir görüntü XY düzlemleri hücreleri ve vegetatif meristem ve yaprak primordia arasında oluşan sınır ortaya koymaktadır.
3D projeksiyon görünümü daha şekil ve domates vegetatif meristem organizasyonu kapsamlı bir görünüm sağlayabilir. Burada gösterilen soya fasulyesi ateş apikal meristem ortasından bir ortogonal görünümü ve aynı ateş apikal meristem bir 3D projeksiyon. Kubbe benzeri vegetatif meristem ve türetilmiş yeni yaprak primordia da gözlemlenebilir.
Propidium iyodür kolayca büyük ölçüde görüntülerin kalitesini etkileyecek hasarlı veya ölü hücreleri leke olabilir, bu yüzden ateş apikal meristem örnekleri hazırlarken herhangi bir fiziksel hasar önlemek için önemlidir.
