Atire em meristems apical controle o crescimento e a reprodução das plantas. Este método nos ajuda a investigar a morfologia e as estruturas internas de meristems apical shoot não apenas nas espécies modelo, mas também em diferentes culturas. Esta técnica é um procedimento muito eficiente.
O meristem apical de tiro pode ser diretamente visualizado em uma alta resolução celular sem qualquer fixação de amostra intensiva em mão-de-obra e etapas de secção de tecidos. Para começar, cultivar plantas arabidopsis, tomate e soja conforme detalhado no protocolo de texto. Corte o ápice de inflorescência das plantas arabidopsis aparafusadas.
Segure a parte basal do caule principal, e use fórceps para remover o maior número possível de órgãos florais mais antigos do caule principal. Continue removendo o resto das flores no campo do microscópio estéreo até que o meristem apical de tiro possa ser visto a partir das oculares. Para ver os meristamos vegetativos apical de tomate ou soja, dissecar os cotilledons, folhas e raízes da planta.
Segure os hipocotilas da planta sob o microscópio estéreo, e use fórceps para dissecar ainda mais as folhas e a folha primordia cobrindo os meristems de brotos vegetativos. Pipeta 50 microliters de solução de iodeto de propidium em uma placa de Petri limpa e vazia. Mergulhe todo o ápice de tiro dissecado em corante por dois minutos.
Durante o processo de coloração, mergulhe toda a inflorescência atire meristem apical ou meristem de tiro vegetativo na solução de iodeto propidium para alcançar a coloração uniforme. Enxágüe o ápice de tiro manchado duas vezes em água estéril e deionizada. Agora, fure um buraco no centro de uma antena de imagem preparada usando fórceps, e coloque o ápice manchado de tiro ereto no meio.
Encha o prato de imagem com água estéril e deionizada para imergir completamente a amostra. Veja a amostra através do microscópio estéreo. Pipeta para cima e para baixo para remover bolhas de ar presas ao redor do meristem.
Em seguida, ajuste o ângulo da haste no ágar para ter certeza de que o meristem apical de tiro é totalmente visível diretamente acima. Agora, coloque o prato de imagem no estágio amostral do microscópio confocal. Abaixe a lente de mergulho de água e levante o estágio da amostra do microscópio para deixar a ponta da lente mergulhar na água.
Abra o software de microscópio confocal e use as oculares para localizar e focar no meristem apical de tiro no campo brilhante. Opere a função Aquisição no software de microscópio confocal. Inicie o modo ao vivo para visualizar a amostra a partir da tela do computador e configure todos os parâmetros para o experimento de varredura a laser.
Ao ajustar os parâmetros, use a função Indicador de alcance para definir se o sinal está saturado ou não. O mesmo software que foi usado para aquisição de imagens pode ser usado para visualizar uma projeção transparente tridimensional. Abra o arquivo confocal original, clique no menu 3D e selecione Transparente para gerar uma exibição de projeção 3D.
Opcionalmente, selecione Transparência para ajustar três parâmetros da projeção, incluindo Limiar, Rampa e Máximo para a transparência da imagem 3D. Agora, selecione Luz para ajustar o brilho da imagem 3D. Exporte as imagens projetadas e salve-as como arquivos TIFF.
Para visualizar a visão de codificação de profundidade das imagens 3D, use o mesmo software. Novamente, clique no menu 3D e selecione Aparência. Selecione Especial e selecione Codificação de profundidade.
Exporte as imagens projetadas e salve-as como arquivos TIFF. Esta imagem da seção ortogonal até o meio da Arabidopsis shoot apical meristem mostra que as paredes horizontais estão manchadas com iodeto de propídio em quase todas as células em múltiplas camadas celulares. Uma visão de uma seção transversal através do corpus da inflorescência shoot apical meristem mostra que as células do plano XY também são claramente imagens.
A visão de projeção 3D revela que a inflorescência meristem forma uma estrutura semelhante a uma cúpula e é cercada pela primordia da flor em desenvolvimento. Esta imagem da seção ortogonal até o meio do molho de tomate apical meristem também mostra que as paredes horizontais estão manchadas com iodeto de propídio em múltiplas camadas celulares, embora o sinal de iodeto propidium da região interior profunda seja ligeiramente menor. Uma imagem de uma seção transversal através das camadas profundas do meristem apical de tiro vegetativo revela as células dos planos XY e a fronteira formada entre o meristem vegetativo e a folha primordia.
A visão de projeção 3D pode fornecer ainda uma visão abrangente da forma e organização do meristem vegetativo do tomate. Mostrado aqui é uma visão ortogonal através do meio do broto de soja apical meristem e uma projeção 3D do mesmo meristem apical tiro. O meristem vegetativo em forma de cúpula e sua nova folha derivada primordia também são observáveis.
O iodeto de propidium pode facilmente manchar células danificadas ou mortas, o que influenciará muito a qualidade das imagens, por isso é importante evitar qualquer dano físico enquanto prepara amostras de meristem apical.
