ピカルメリステムコントロール植物の成長と再生を撃つ。この方法は、モデル種だけでなく、異なる作物においても、射成頭突起メリステムの形態と内部構造を調査するのに役立ちます。この手法は非常に効率的な手順です。
シュートアピカルメリステムは、労働集約的なサンプル固定および組織断面のステップなしで、高い細胞分解能で直接視覚化することができます。まず、テキストプロトコルで詳述されているように、シロイヌナズナ、トマト、大豆の植物を栽培します。ボルトで締まったシロイヌナズナの植物から花序を撃つ頂点をカットします。
主茎の基底部分を保持し、メインステムからできるだけ多くの古い花の臓器を除去するために鉗子を使用します。撮影の頭柱メリステムが接眼点から見えるまで、ステレオ顕微鏡のフィールドで残りの花を取り除き続けます。トマトまたは大豆のいずれかから栄養芽の樹状メリステムを見るには、植物からコチルドン、葉、根を解剖します。
植物の低酸素をステレオ顕微鏡で保持し、鉗子を使用して、栄養シュートのアピカルメリステムを覆う葉と葉の原始子をさらに解剖します。ピペット50マイクロリットルのプロピジウムヨウ化液を清潔で空のペトリ皿に入れます。解剖したシュートの頂点全体を染料に2分間浸します。
染色プロセス中に、花序の芽生全体を浸漬する有端メリステムまたは栄養シュートのピオシド溶液にピオシド溶液を浸し、均一な染色を達成する。染色されたシュートの頂点を滅菌、脱イオン水で2回リンスします。今、鉗子を使用して準備された画像皿の中心に穴を開け、汚れたシュートの頂点を媒体に直立に貼り付けます。
イメージング皿に無菌の脱イオン水を充填し、サンプルを完全に浸漬します。検体顕微鏡を通してサンプルを見る。メリステムの周りに閉じ込められた気泡を取り除くために上下のピペット。
次に、寒天の茎の角度を調整して、真上から完全に見えるようにします。次に、共焦点顕微鏡のサンプルステージにイメージング皿を置きます。水浸漬レンズを下げ、顕微鏡サンプルステージを上げてレンズの先端を水中に浸します。
共焦点顕微鏡ソフトウェアを開き、接眼レンズを使用して、明るい分野でのシュートのアペリカルメリステムを見つけて集中させます。共焦点顕微鏡ソフトウェアで取得機能を操作します。ライブモードを起動して、コンピュータ画面からサンプルを表示し、レーザースキャン実験のすべてのパラメータを設定します。
パラメータを調整する場合は、レンジインジケータ関数を使用して、信号が飽和しているかどうかを定義します。撮像に使用したのと同じソフトウェアを、3次元の透明投影図を可視化するために使用できます。元のコンフォーカル ファイルを開き、[3D]メニューをクリックし、[透明]を選択して 3D 投影ビューを生成します。
必要に応じて、[透過性]を選択して、3D 画像の透明度に対して[しきい値]、[ランプ]、[最大値]など、投影の 3 つのパラメータを調整します。次に、[ライト]を選択して、3D 画像の明るさを調整します。投影されたイメージをエクスポートし、TIFF ファイルとして保存します。
3D 画像の深度コーディングビューを視覚化するには、同じソフトウェアを使用します。もう一度、[3D]メニューをクリックし、[外観]を選択します。[特殊] を選択し、[深度コーディング] を選択します。
投影されたイメージをエクスポートし、TIFF ファイルとして保存します。この画像は、シロイヌナズナの中間部を通って、複数の細胞層のほぼすべての細胞にヨウ化プロピジウムで水平壁が染色されていることを示しています。花序の脳を通る1つの横断断面のビューは、XY平面からの細胞も明確に画像化されていることを示している。
3D投影ビューは、花序メリステムがドーム状の構造を形成し、現像花のプリモリアに囲まれていることを明らかにします。このトマトシュートの中間部からピオヒレメリステムの中間までのこの画像は、深い内部領域からのヨウ化プロピジウム信号がわずかに低いが、複数の細胞層でヨウ化プロピジウムで水平壁が染色されていることを示している。1つの横断セクションから栄養芽球の精液柱の深い層を通る画像は、XY平面からの細胞と栄養メリステムと葉プリモリアの間に形成された境界を明らかにする。
3D投影ビューは、トマトからの栄養性メリステムの形状と組織の包括的なビューを提供することができます。ここに示されているのは、大豆シュートの真ん中を通る直交図と、同じシュートのアペリカルメリステムの3D投影です。ドーム状の栄養性メリステムとその派生した新しい葉のプリモディアも観察可能です。
ヨウ化プロピジウムは損傷または死んだ細胞を容易に染色することができ、画像の品質に大きな影響を与えるため、ピオメリステムサンプルを撮影する間に物理的な損傷を避ける必要があります。
