שיטה זו נותנת מענה לאתגרים בתצפית פלואורסצנטית עמוקה ב-Rice Shoots, כגון חדירה מוגבלת לרקמות של תמיסת הניקוי והרזולוציה האמיתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תצפית מבנה של רקמות גדולות בהרבה מנקודת מבט מאקרו, אפילו הנחיות עם רקמות קשות ועבות, כגון יורה למבוגרים. שיטה זו חלה על הדמיה עמוקה של רקמות קשות ועבות במיני צמחים רחבים.
זה יכול לעזור להאיץ את הגילוי של תופעות חדשות במחקר ביולוגי של צמחים. כדי להתחיל, לחתוך את השורשים בזהירות מבלי לפגוע בצמחים ולשטוף אותם עם מים כדי להסיר את הלכלוך. כעת, השתמשו בפינצטה כדי לקלף את העלים החיצוניים הישנים.
כדי להימנע מריסוק התאים, השתמש בתער בעל קצוות בודדים עם תנועת החלקה כדי לחתוך את הרקמה מהירי, מריסטם אפיקלי או פאניקה צעירה לבסיס. אם המיקום של הירי apical meristem או פאניקה צעירה אינו גלוי, לחתוך אותו יותר. לירי האורז יש חתך סגלגל.
השתמש בתער בעל קצוות כפולים כדי לגלח צד אחד של האליפסה באופן דק, בכיוון הציר הארוך שלה. אשר את המיקום של היורה apical meristem או פאניקה צעירה על ידי המראה של צבע לבן בדגימה לחתוך את הרקמה עודפת. שים את הדגימה בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסה מקבעת.
חותכים חתיכת סרט פרפין בגודל 2.5 סנטימטרים רבועים ומעצבים אותה לכדור. כעת, הניחו את הכדורים האלה על גבי הדגימות כדי למנוע מהם לצוף החוצה מהתמיסה המתקבעת. מניחים את הצינור המכיל את הדגימה בתוך ייבוש.
סגרו את המכסה של חומר הייבוש והפעילו את משאבת הוואקום כדי לדכא באיטיות את החלק הפנימי של חומר הייבוש עד להגעה ללחץ של מינוס 0.095 מגה-פסקל. לאחר סגירת הייבוש במינוס 0.095 מגה-פסקל, כבו את משאבת הוואקום ותנו לה לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. פותחים מעט את הייבוש ומחזירים אותו לאט לאט ללחץ האטמוספרי.
אם הדגימה קבועה כראוי היא שוקעת לתוך הפתרון המתקן. ואם הוא לא שוקע, להפחית את הלחץ שוב. הסר את סרט הפרפין.
סגרו את המכסה, והשאירו את הצינורות למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מגבונים נטולי מוך, הסר את התמיסה המקובעת העודפת מהדגימה וקבע את הדגימה על מגש מיקרו-פריסה רוטט עם דבק מיידי. הניחו את הדגימה על מגש עם הצד השטוח כלפי מטה אשר גולח במהלך הדגימה וקבעו את תנאי החיתוך בהתאם לדגימה הקבועה.
התאם את מיקום הדגימה באמצעות לחצן הפוך או קדימה ולחצן למעלה או למטה ומלא את המגש במים שעברו דה-יוניזציה עד שכל הדגימות ישקעו. לאחר מילוי המגש, לחץ על לחצן התחל והנח את הדוגמאות החתוכות על שקופית זכוכית עם טיפת PBS. בדוק את הדגימה המכילה את אתר היעד תחת מיקרוסקופ סטריאו והעבר את הדגימה החתוכה לצלחת מרובת בארות עם מיליליטר אחד של PBS.
הסר את ה- PBS מהצלחת מרובת הבארות. הוסיפו PBS טרי ותנו לו לעמוד במשך דקה אחת. הסר PBS והוסף את CS. מניחים את הצלחת הרב-בארית המכילה את הדגימה במייבש וסוגרים את המכסה.
ואז להפעיל את משאבת ואקום כדי לדכא את החלק הפנימי של desiccator עד מינוס 0.09 megapascals, לאט. לאחר סגירת הייבוש במינוס 0.09 מגה-פסקל, כבה את משאבת הוואקום ותן לה לעמוד במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. פותחים מעט את הייבוש ומחזירים אותו לאט לאט ללחץ האטמוספרי.
יוצקים מים שעברו דה-יוניזציה לתוך המרווח בין הבארות כדי למנוע את אידוי ה-CS ומאחסנים את הלוחות מרובי הבארות בטמפרטורת החדר בחושך לצורך ניקוי. כאשר CS הופך ירוק, החלף אותו בפתרון חדש. הדגימות שלא נחתכו נשארו ירוקות ולא הפכו לשקופות לאחר שלושה חודשי טיפול בדגימות CS.In שהתקלפו מכל העלים הצמתים הפכו לבנים לאחר שבוע, אם כי הצמתים נשארו ירוקים.
הדגימה לא הפכה לשקופה לאחר ארבעה שבועות. הדגימות שנחתכו ביד הפכו לבנות לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב, אך לא הפכו לשקופות לאחר ארבעה שבועות. הדגימות שקוצצו לעובי של 130 מיקרומטר הפכו שקופות לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב.
הדגימה הייתה כמעט שקופה לאחר שבועיים. בצומת, העומק הנצפה לאחר שבוע של טיפול CS היה מינוס 60 מיקרומטר ומינוס 90 מיקרומטר לאחר שבועיים. אותות פלואורסצנטיים נצפו בעומק של מינוס 80 מיקרומטר בשלושה שבועות ובעומק של מינוס 100 מיקרומטר בארבעה שבועות.
באינטרנודה נצפו אותות פלואורסצנטיים בעומק של מינוס 60 מיקרומטר ללא טיפול CS. העומק הנצפה היה מינוס 90 מיקרומטר לאחר שבוע עד שלושה שבועות של טיפול CS ומינוס 100 מיקרומטר לאחר ארבעה שבועות. בעלים נצפו אותות פלואורסצנטיים בעומק של מינוס 90 מיקרומטר ללא טיפול CS, אך הבהירות הייתה חלשה יותר מרקמות אחרות.
לאחר שבוע, האותות היו בהירים יותר ונצפו בעומק של מינוס 120 מיקרומטר. הביטוי של גורם השעתוק OS MASU 15 mOrange נצפה בפאניקה צעירה, עלה, צומת, אינטרנודה ופלורט. המפתח הוא למצוא את התנאים הטובים ביותר עבור הצמחים או הרקמות, למשל, לחץ מחזור ואקום, או מיקום, וטיפול CS, תזמון, עובי, מהירות ותמיסת צביעה מתאימה.
השילוב של תזמון וטכנולוגיית ריפוי מאפשר תצפית טמפורלית מרחבית של דפוס ביטוי גנים ותקשורת בין-תאית ברקמות מרובות של מקטע אחד.
