Les mésentèmes apicals contrôlent la croissance et la reproduction des plantes. Cette méthode nous aide à étudier la morphologie et les structures internes des meristems apiques de pousse non seulement dans les espèces modèles, mais aussi dans différentes cultures. Cette technique est une procédure très efficace.
Le meristem apical de pousse peut être directement visualisé dans une résolution cellulaire élevée sans n’importe quelle fixation d’échantillon laborieux et étapes de sectionnement de tissu. Pour commencer, cultivez des arabidopsis, des tomates et des plants de soja, comme le détaille le protocole du texte. Coupez l’apex de pousse d’inflorescence des usines boulonnées d’Arabidopsis.
Tenez la partie basale de la tige principale et utilisez des forceps pour enlever autant d’organes floraux plus anciens que possible de la tige principale. Continuez à enlever le reste des fleurs dans le champ du microscope stéréo jusqu’à ce que le meristem apical de pousse puisse être vu des oculaires. Pour voir les meristems apical de pousse végétative de tomate ou de soja, disséquez les cotyléons, les feuilles, et les racines de la plante.
Maintenez les hypocotyles de la plante sous le microscope stéréo, et utilisez des forceps pour disséquer davantage les feuilles et les primordies foliiques couvrant les mésentèmes apiques de pousse végétative. Pipette 50 microlitres de solution d’iodure de propidium dans une boîte de Pétri propre et vide. Tremper l’ensemble de l’apex de pousse disséqué dans le colorant pendant deux minutes.
Pendant le processus de coloration, immerger l’ensemble de l’inflorescence tirer meristem apical ou végétatif pousse meristem apical dans la solution iodure propidium pour atteindre la coloration uniforme. Rincer le sommet de la pousse tachée deux fois dans de l’eau stérile et déionisée. Maintenant, percer un trou au centre d’un plat d’imagerie préparé à l’aide de forceps, et coller la pousse tachée apex droit dans le milieu.
Remplissez le plat d’imagerie d’eau stérile et déionisée pour immerger complètement l’échantillon. Visualisez l’échantillon au microscope stéréo. Pipette de haut en bas pour enlever les bulles d’air emprisonnées autour du meristem.
Ensuite, ajustez l’angle de la tige dans l’agar pour vous assurer que le meristem apical de pousse est entièrement visible d’en haut. Maintenant, placez le plat d’imagerie sur l’étape de l’échantillon du microscope confocal. Abaissez la lentille qui plonge l’eau et soulevez le stade de l’échantillon du microscope pour laisser la pointe de la lentille plonger dans l’eau.
Ouvrez le logiciel de microscope confocal, et utilisez les oculaires pour localiser et se concentrer sur le meristem apique de pousse dans le champ lumineux. Exploitez la fonction Acquisition dans le logiciel de microscope confocal. Démarrez le mode live pour afficher l’échantillon à partir de l’écran de l’ordinateur, et configurez tous les paramètres de l’expérience de balayage laser.
Lors de l’ajustement des paramètres, utilisez la fonction Indicateur de plage pour définir si le signal est saturé ou non. Le même logiciel qui a été utilisé pour l’acquisition d’imagerie peut être utilisé pour visualiser une projection transparente tridimensionnelle. Ouvrez le fichier confocal d’origine, cliquez sur le menu 3D et sélectionnez Transparent pour générer une vue de projection 3D.
En option, sélectionnez Transparence pour ajuster trois paramètres de la projection, y compris Threshold, Ramp et Maximum pour la transparence de l’image 3D. Maintenant, sélectionnez Lumière pour ajuster la luminosité de l’image 3D. Exportez les images projetées et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF.
Pour visualiser la vue de codage en profondeur des images 3D, utilisez le même logiciel. Encore une fois, cliquez sur le menu 3D et sélectionnez Apparence. Sélectionnez Spécial et sélectionnez Codage de profondeur.
Exportez les images projetées et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF. Cette image de la section orthogonale au milieu de l’Arabidopsis tirer meristem apical montre que les murs horizontaux sont tachés d’iodure de propidium dans presque toutes les cellules à plusieurs couches cellulaires. Une vue d’une section transversale à travers le corpus de l’inflorescence tirer meristem apical montre que les cellules du plan XY sont également clairement image.
La vue de projection 3D révèle que le meristem d’inflorescence forme une structure en forme de dôme et est entouré par la primordia de fleur en développement. Cette image de la section orthogonale au milieu du meristem apique de pousse de tomate montre également que les murs horizontaux sont souillés avec l’iodure de propidium à plusieurs couches cellulaires, bien que le signal d’iodure de propidium de la région intérieure profonde soit légèrement inférieur. Une image d’une section transversale à travers les couches profondes du meristem apical de pousse végétative révèle les cellules des plans XY et la frontière formée entre le meristem végétatif et la primordia de feuille.
La vue de projection 3D peut en outre fournir une vue complète de la forme et de l’organisation du meristem végétatif de la tomate. Montré ici est une vue orthogonale à travers le milieu de la pousse de soja meristem apical et une projection 3D de la même pousse meristem apical. Le meristem végétatif en forme de dôme et sa nouvelle primordia de feuilles dérivées sont également observables.
L’iodure de propidium peut facilement tacher les cellules endommagées ou mortes, ce qui influencera considérablement la qualité des images, il est donc important d’éviter tout dommage physique lors de la préparation de tirer des échantillons de mésoïsme apical.
