Schießen Sie apikale Meristems steuern Pflanzenwachstum und Fortpflanzung. Diese Methode hilft uns, die Morphologie und die inneren Strukturen von Trieb-apikalen Meristems nicht nur in den Modellarten, sondern auch in verschiedenen Kulturen zu untersuchen. Diese Technik ist ein sehr effizientes Verfahren.
Shoot apical Meristem kann direkt in einer hohen zellulären Auflösung ohne arbeitsintensive Probenfixierung und Gewebeschnitt Schritte visualisiert werden. Zunächst wachsen Arabidopsis, Tomaten- und Sojapflanzen, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie den Blütenstand Schießen Spitze aus den verschraubten Arabidopsis Pflanzen.
Halten Sie den Basalteil des Hauptstamms und verwenden Sie Zangen, um so viele ältere Blütenorgane wie möglich aus dem Hauptstamm zu entfernen. Entfernen Sie weiterhin die restlichen Blumen im Bereich des Stereomikroskops, bis das schießende apikale Meristem von den Okularen aus betrachtet werden kann. Um den vegetativen Trieb apikalmer meristems von Tomaten oder Sojabohnen zu sehen, sezieren Sie die Kotyledonen, Blätter und Wurzeln aus der Pflanze.
Halten Sie die Hypocotyle der Pflanze unter dem Stereomikroskop, und verwenden Sie Zangen, um die Blätter und Blattprimordien, die die vegetativen Trieb eapikalen Meristems bedecken, weiter zu sezieren. Pipette 50 Mikroliter Propidiumjodidlösung in einer sauberen und leeren Petrischale. Tauchen Sie die gesamte sezierte Triebspitze für zwei Minuten in Farbstoff.
Tauchen Sie während des Färbevorgangs den gesamten Blütenstand ein, der apikale Meristem oder vegetative Trieb-Apische in die Propidiumjodidlösung schießt, um eine gleichmäßige Färbung zu erreichen. Spülen Sie den gefärbten Triebspitze zweimal in sterilem, entionisiertem Wasser. Nun durchbohren Sie ein Loch in der Mitte einer vorbereiteten bildgebenden Schale mit Zangen, und kleben Sie die gefärbte Triebspitze aufrecht in das Medium.
Füllen Sie die bildgebende Schale mit sterilem, entionisiertem Wasser, um die Probe vollständig einzutauchen. Sehen Sie sich die Probe durch das Stereomikroskop an. Pipette nach oben und unten, um Luftblasen zu entfernen, die um das Meristem gefangen sind.
Passen Sie dann den Winkel des Stiels im Agar an, um sicherzustellen, dass der Trieb-Apische Meristem von direkt von oben vollständig sichtbar ist. Platzieren Sie nun die Bildform auf der Probenstufe des konfokalen Mikroskops. Senken Sie die wassertauchende Linse, und heben Sie die Mikroskop-Probestufe, um die Linsenspitze ins Wasser tauchen zu lassen.
Öffnen Sie die konfokale Mikroskop-Software, und verwenden Sie die Okularen, um den Schieß-Apischen Meristem im hellen Feld zu lokalisieren und zu fokussieren. Betreiben Sie die Erfassungsfunktion in der konfokalen Mikroskopsoftware. Starten Sie den Live-Modus, um das Beispiel vom Computerbildschirm aus anzuzeigen, und richten Sie alle Parameter für das Laserscanexperiment ein.
Verwenden Sie beim Anpassen der Parameter die Funktion Bereichsanzeige, um zu definieren, ob das Signal gesättigt ist oder nicht. Die gleiche Software, die für die Bildaufnahme verwendet wurde, kann zur Visualisierung einer dreidimensionalen transparenten Projektion verwendet werden. Öffnen Sie die ursprüngliche konfokale Datei, klicken Sie auf das 3D-Menü, und wählen Sie Transparent aus, um eine 3D-Projektionsansicht zu generieren.
Wählen Sie optional Transparenz aus, um drei Parameter der Projektion anzupassen, einschließlich Schwellenwert, Rampe und Maximum für die Transparenz des 3D-Bildes. Wählen Sie nun Licht aus, um die Helligkeit des 3D-Bildes anzupassen. Exportieren Sie die projizierten Bilder, und speichern Sie sie als TIFF-Dateien.
Verwenden Sie dieselbe Software, um die Tiefencodierungsansicht der 3D-Bilder zu visualisieren. Klicken Sie erneut auf das 3D-Menü, und wählen Sie Aussehen aus. Wählen Sie Spezial aus, und wählen Sie Tiefencodierung aus.
Exportieren Sie die projizierten Bilder, und speichern Sie sie als TIFF-Dateien. Dieses Bild aus dem orthogonalen Abschnitt durch die Mitte des Arabidopsis-Schießens zeigt, dass die horizontalen Wände in fast allen Zellen in mehreren Zellschichten mit Propidiumjodid befleckt sind. Ein Blick auf einen Querschnitt durch den Korpus des Blütenstandesschießens zeigt, dass die Zellen aus der XY-Ebene ebenfalls klar abgebildet sind.
Die 3D-Projektionsansicht zeigt, dass das Blütenstand-Meristem eine kuppelartige Struktur bildet und von der sich entwickelnden Blütenprimordia umgeben ist. Dieses Bild aus dem orthogonalen Abschnitt durch die Mitte des Tomatentriebs apischen Meristem zeigt auch, dass die horizontalen Wände mit Propidiumjodid an mehreren Zellschichten gefärbt sind, obwohl das Propidiumiodidsignal aus dem tiefen Inneren etwas niedriger ist. Ein Bild aus einem Querschnitt durch die tiefen Schichten des vegetativen Trieb-Apischen Meristamms zeigt die Zellen der XY-Ebenen und die Grenze zwischen dem vegetativen Meristem und der Blattprimordia.
Die 3D-Projektionsansicht kann darüber hinaus einen umfassenden Überblick über die Form und Organisation des vegetativen Meristes aus Tomaten bieten. Hier ist eine orthogonale Ansicht durch die Mitte des Sojabohnen-Schießens apikalmeristem und eine 3D-Projektion des gleichen Trieb apischen Meristem gezeigt. Das kuppelartige vegetative Meristem und seine abgeleiteten neuen Blattprimordien sind ebenfalls beobachtbar.
Propidiumiodid kann leicht beschädigte oder abgestorbene Zellen färben, was die Qualität der Bilder stark beeinflussen wird, daher ist es wichtig, bei der Vorbereitung von apikalen Meristemproben zu vermeiden, dass es keine physischen Schäden verursacht.
