הליך זה מתאר את האוסף של אזורי מוח קפואים דיסקרטיים כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה RNA באמצעות כלים זולים זמינים בדרך כלל. מכיוון ואזורי מוח נשמרים קפואים מהקציר באמצעות ניתוח, מולקולות היעד נשמרות והחוקר יש זמן לנתח ולאחסן בזהירות אזורים מעניינים. זיהוי אזורי עניין יכול בתחילה להיות מאתגר.
שימוש בציוני דרך נפוצים במוח כשהם מגיחים ונ נסוגים דרך החלקים ביחס לאזורים הרצויים יבהיר את הזיהוי. לאחר הסרת מוחות מעכברי CD-1 פראיים בוגרים שעברו המתת דם, פלאש מקפיא את הרקמה למשך 60 שניות בחנקן נוזלי או באירופנטאן. מצננים מראש עם קרח יבש ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
24 שעות לפני ניתוח הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקייה על ערימה של חבילות מקפיא מופשרות. וכריך את הצדדים למטריצה בין שתי חבילות מקפיא הקפדה להשאיר כחצי סנטימטר בין החלק התחתון של חריצי התער ואת החלק העליון של האריזות. הגדר צלחת זכוכית קפואה עבור הניתוח על ידי מילוי קופסה מבודדת עם קרח עד כחמישה סנטימטרים מלמעלה.
לאחר מכן מניחים שכבה של 2.5 ס"מ של קרח יבש על גבי. ולכסות אותו עם יריעות פלסטיק שחורות. מניחים צלחת זכוכית על גבי הפלסטיק.
וקרח יבש סביב גבולות הצלחת. מוציאים את מטריצת המוח הקפואה מהמקפיא ומכניסים את המוח, את קליפת המוח למעלה, למטריצה. אפשר לרקמה לצייד לטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות.
שמירה על המכסה פתוח במהלך תקופה זו. השתמש במטליות קרות כדי להתאים את מיקום המוח במטריצה כך שסינוס הסגיטל וסינוס רוחבי ינקו עם החריצים הניצבים של הבלוק. ברגע שהמוח נמצא בעמדה, מניחים סכין גילוח מצונן ליד מרכזו ולחץ עליו כמילימטר לתוך הרקמה.
לאחר מכן, מניחים להב מצונן אחד בכל קצה של המוח ולחץ כל הדרך למטה לתוך המטריצה. ואז להתחיל להוסיף להבים מצוננים בקצה rostral, הצבת אותם לתוך החריצים אחד בכל פעם בעדינות לחיצה עליהם מילימטר אחד לתוך הרקמה. המשך להוסיף להבים במרווחי זמן של מילימטר אחד, עובד לכיוון הקצה caudal.
כאשר כל הלהבים נמצאים במקום, לחץ למטה מלמעלה עם אצבעות, כף יד, או אובייקט קהה ולנענע אותם לאט מצד לצד כדי להזיז אותם דרך הרקמה. לאחר שהלהבים הגיעו לתחתית החריצים, תפסו כל צד של קבוצת הלהבים ושחררו אותם מהמטריצה על ידי התנדנדות קדימה ואחורה. לאחר לשחרר את הקבוצה של להבים למקם אותם בצד rostral על צלחת הזכוכית, ולשים קרח יבש ליד או על גבי הערימה כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות להפרדה קלה יותר.
לאחר מכן מקם את הערימה עם קצוות חדים כלפי מטה והפרד את הלהבים על-ידי הסטת הערימה בין האגודל והאצבעות. מרפדים את החלק על לוחות הזכוכית מ rostral כדי caudal ולהפריד את הרקמה מן הלהבים על ידי כיפוף אותם בין האצבעות, או על ידי הפרדתם עם להב מצונן שני. לפעמים, רקמה עשויה להידבק לשני הצדדים של להב ויש לנקוט בזהירות כדי לשמור על כיוון rostral כדי caudal.
לפני תחילת הניתוח, פתח את אטלס המוח של עכבר אלן או התייחסות אחרת ולמצוא את ציוני הדרך הדרושים כדי לזהות אזורים מעניינים. השתמש במקלפים או להבים צוננים כדי להפוך את החלק. וודא שאזור העניין עקבי לאורך כל הסעיף.
חותכים לתוך החלק עם אזמל נקי או אגרוף, דוחף את המתכת בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה. נדנדה אותו קדימה ואחורה כדי להפוך את החתך. לאחר קצירת אזור העניין, מניחים אותו לתוך צינורות 1.5 מילימטר מקורר מראש ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לעבד את הרקמה, להוסיף מאגר RIPA קר עבור מיצוי חלבון או guanidinium המכיל ממס עבור מיצוי RNA ומיד הומוגניזציה אותו עם זכוכית downs או homogenizer מכני. כדי לאמת שיטה זו, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית נאספה מעכברים זכרים מסוג CD-1 פראי למבוגרים, ו- RNA וחלבון התאפיינו. כאשר מנתחים אותו באמצעות אלקטרופורזה נימית, RNA מושפל מציג אובדן בעוצמת הרצועות הריבוזומליות 28S ו- 18S, כמו גם מריחה בין 25 ל -200 נוקלאוטידים.
בעוד RNA באיכות גבוהה מראה להקות ריבוזומליות נפרדות מעט עד ללא אות באזור המשקל המולקולרי התחתון. RNA להשיג באמצעות שיטת ניתוח קפוא הושווה RNA מוכן רקמה שנקטפו טרי. שתי השיטות מייצרות רנ"א עם מספרי יושרה גבוהים ורצועות ריבוזומליות חזקות.
כדי לאשר כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לשמר את microenvironment של רקמה נותחו לניתוח מאוחר יותר, RNA חולץ קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלית נותח שאוחסן במשך מספר שבועות. כל הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם פסים ריבוזומליים מובהקים ומספרי שלמות RNA מעל שמונה. כדי לאשר את שלמות החלבון של הדגימות המנותרות הקפואות, החלבון נאסף, הועבר לניטרוסלולוס ובדיקה עם נוגדנים נגד יעד המשקל המולקולרי הגבוה KCC2, ואקטין חלבון במשקל מולקולרי נמוך יותר.
בכל המקרים הלהקות היו חדות ומובחנות ללא מוצרי פירוט ניכרים. חשוב לשמור על הרקמות קפואות לאורך כל התהליך כמו זה משמר את microenvironment של החלקים ולשמור על מורפולוגיה סעיף להשוואה עם תמונות אטלס המוח. אזורי עניין שנאספו באופן זה ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי, והוא יכול להיות מנוצל ביישומים רבים במורד הזרם, כולל RT-qPCR, RNA-Seq, ניתוח כתם מערבי, ו HPLC.
שיטה זו שימשה כדי לחקור שינויים מולקולריים בתוך המערכות הלימביות של מכרסמים פרינטליים שנחשפו ל- THC וקנבינואידים אחרים כדי להבין טוב יותר כיצד תרופות אלה עשויות להשפיע על התפתחות המוח.
