Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles. Debido a que las regiones cerebrales se mantienen congeladas de la cosecha a través de la disección, las moléculas diana se conservan y el investigador tiene tiempo para diseccionar y almacenar cuidadosamente las regiones de interés. Identificar regiones de interés puede ser inicialmente difícil.
El uso de puntos de referencia cerebral comunes a medida que surgen y retroceden a través de las secciones en relación con las regiones deseadas hará que la identificación sea clara. Después de eliminar los cerebros de ratones adultos eutanizados de tipo salvaje CD-1, congelar el tejido durante 60 segundos en nitrógeno líquido o isopentano. Pre-enfriar con hielo seco y almacenarlo en menos 80 grados Celsius.
24 horas antes de diseccionar el tejido, coloque una matriz cerebral limpia en una pila de paquetes de congelador descongelados. Y empareje los lados a la matriz entre dos paquetes de congelador asegurándose de dejar aproximadamente medio centímetro entre la parte inferior de las ranuras de afeitar y la parte superior de los paquetes. Configure una placa de vidrio congelada para la disección llenando una caja aislada con hielo hasta aproximadamente cinco centímetros desde la parte superior.
A continuación, coloque una capa de 2,5 centímetros de hielo seco en la parte superior. Y cúbrelo con láminas de plástico negro. Coloque una placa de vidrio encima del plástico.
Y hielo seco alrededor de los bordes de la placa. Retire la matriz cerebral congelada del congelador e inserte el cerebro, del lado de la corteza hacia arriba, en la matriz. Deje que el tejido se equilibre a la temperatura de la caja durante 10 minutos.
Mantener la tapa abierta durante este tiempo. Utilice fórceps fríos para ajustar la posición del cerebro en la matriz de modo que el seno sagital y el seno transversal se alineen con las ranuras perpendiculares del bloque. Una vez que el cerebro esté en posición, coloque una cuchilla de afeitar fría cerca de su centro y presione aproximadamente un milímetro en el tejido.
A continuación, coloca una hoja fría en cada extremo del cerebro y presiona hasta abajo en la matriz. Luego comience a agregar cuchillas refrigeradas en el extremo rostral, colocándolas en las ranuras de una en una y presionando suavemente un milímetro en el tejido. Continúe agregando cuchillas a intervalos de un milímetro, trabajando hacia el extremo caudal.
Cuando todas las cuchillas estén en su lugar, presione hacia abajo en la parte superior con los dedos, la palma de la mano o un objeto contundente y mece lentamente de lado a lado para moverlas a través del tejido. Una vez que las cuchillas hayan llegado a la parte inferior de las ranuras, agarre cada lado del grupo de cuchillas y libéntelas de la matriz balanceándose hacia adelante y hacia atrás. Después de liberar el grupo de cuchillas colocarlos lado rostral hacia arriba en la placa de vidrio, y poner hielo seco al lado o en la parte superior de la pila para congelar aún más las muestras para una separación más fácil.
A continuación, coloque la pila con bordes afilados hacia abajo y separe las cuchillas desplazando la pila entre el pulgar y los dedos. Alinee la sección en las placas de vidrio de rostral a caudal y separe el tejido de las cuchillas flexionándolas entre los dedos, o separándolas con una segunda hoja refrigerada. A veces, el tejido puede adherirse a ambos lados de una cuchilla y se debe tener cuidado para mantener la orientación rostral a caudal.
Antes de iniciar la disección, abra Allen Mouse Brain Atlas u otra referencia y encuentre los puntos de referencia necesarios para identificar las regiones de interés. Utilice fórceps o cuchillas refrigeradas para voltear la sección. Y asegúrese de que la región de interés sea coherente en toda la sección.
Cortar en la sección con un bisturí limpio o un puñetazo, empujando el metal suavemente pero firmemente en el tejido. Mecándolo de un lado a otro para hacer el corte. Después de cosechar la región de interés, colóquela en tubos pre-refrigerados de 1,5 milímetros etiquetados y guárdelos a menos 80 grados Centígrados.
Para procesar el tejido, agregue el tampón RIPA frío para la extracción de proteínas o un disolvente que contenga guanidinio para la extracción de ARN y homogeneice inmediatamente con un desgarro de vidrio o un homogeneizador mecánico. Para validar este método, la corteza prefrontal medial se recogió de ratones macho adultos de tipo salvaje CD-1, y se caracterizaron arneses y proteínas. Cuando se analiza con electroforesis capilar, el ARN degradado muestra una pérdida en la intensidad de las bandas ribosomales 28S y 18S, así como un frotis entre 25 y 200 nucleótidos.
Mientras que el ARN de alta calidad muestra bandas ribosomales distintas poca o ninguna señal en la región de menor peso molecular. El ARN obtenido utilizando el método de disección congelada se comparó con ARN preparado a partir de tejido recién cosechado. Ambos métodos producen ARN con altos números de integridad y bandas ribosomales fuertes.
Para confirmar que este método se puede utilizar para preservar el microambiente del tejido diseccionado para su posterior análisis, el ARN se extrajo de la corteza prefrontal medial diseccionada que se había almacenado durante varias semanas. Todas las muestras produjeron ARN de alta calidad con bandas ribosomales distintas y números de integridad del ARN por encima de ocho. Para confirmar la integridad proteica de las muestras diseccionadas congeladas, se recogió la proteína, se transfirió a la nitrocelulosa y la sonda con anticuerpos contra el objetivo de alto peso molecular KCC2, y la actina de proteína de menor peso molecular.
En todos los casos las bandas eran afiladas y distintas, sin productos de descomposición discernibles. Es importante mantener los tejidos congelados durante todo el proceso, ya que esto preserva el microambiente de las secciones y mantiene la morfología de la sección para la comparación con las imágenes del atlas cerebral. Las regiones de interés recogidas de esta manera se pueden almacenar durante varios meses a 80 grados Celsius negativos y se pueden utilizar en muchas aplicaciones posteriores, incluyendo RT-qPCR, RNA-Seq, análisis de manchas occidentales y HPLC.
Este método se ha utilizado para explorar los cambios moleculares dentro de los sistemas límbicos de roedores perinatales expuestos a THC y otros cannabinoides para entender mejor cómo estos fármacos pueden afectar el desarrollo cerebral.
