이 절차는 저렴하고 일반적으로 이용 가능한 공구를 사용하여 고품질 단백질 과 RNA를 얻기 위하여 이산 냉동 두뇌 지구의 집합을 기술합니다. 뇌 영역은 해부를 통해 수확에서 얼어 붙은 유지되기 때문에, 표적 분자는 보존되고 연구원은 주의 깊게 해부하고 관심있는 지역을 저장하는 시간이있다. 관심 영역을 식별하는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다.
일반적인 뇌 랜드마크를 사용하여 나타나고 원하는 지역과 관련하여 섹션을 통해 후퇴하면 식별이 명확해집니다. 안락사 성인 CD-1 야생 형 마우스에서 뇌를 제거 한 후, 플래시는 액체 질소 또는 isopentane에서 60 초 동안 조직을 동결. 드라이 아이스로 미리 식히고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
조직을 해부하기 24 시간 전에 해동 된 냉동고 팩 더미에 깨끗한 뇌 매트릭스를 놓습니다. 그리고 면도기 슬롯의 바닥과 팩의 상단 사이에 약 반 센티미터를 남길 수 있도록 두 개의 냉동고 팩 사이에 매트릭스에 측면을 샌드위치. 상단에서 약 5센티미터의 얼음으로 절연 된 상자를 채우어 해부에 얼어 붙은 유리 판을 설정합니다.
그런 다음 2.5센티미터의 드라이 아이스 층을 위에 놓습니다. 그리고 검은 색 플라스틱 시트로 덮습니다. 플라스틱 위에 유리 판을 놓습니다.
그리고 접시의 테두리 주위에 드라이 아이스. 냉동고에서 냉동 뇌 매트릭스를 제거하고 뇌, 피질 측면을 매트릭스에 삽입합니다. 조직이 10 분 동안 상자의 온도에 평형되도록 합니다.
이 시간 동안 뚜껑을 열어 두는 것입니다. 차가운 집게를 사용하여 매트릭스에서 뇌의 위치를 조정하여 시상 부비동과 횡방향 부비동이 블록의 수직 홈과 정렬되도록 합니다. 뇌가 제자리에 있으면 차가운 면도날을 중앙 근처에 놓고 약 1mm를 조직으로 누릅니다.
다음으로, 뇌의 양쪽 끝에 차가운 칼날 하나를 놓고 매트릭스로 모든 방법을 누릅니다. 그런 다음 장밋빛 끝에 차가운 블레이드를 추가하여 한 번에 하나씩 슬롯에 넣고 1 밀리미터를 조직으로 부드럽게 누르기 시작합니다. 1밀리미터 간격으로 블레이드를 계속 추가하여 caudal 끝으로 작업합니다.
모든 블레이드가 제자리에 있을 때 손가락, 손바닥 또는 무딘 물체로 위를 누르고 좌우로 천천히 흔들어 조직을 통해 이동합니다. 블레이드가 슬롯의 바닥에 도달하면 블레이드 그룹의 각 면을 잡고 앞뒤로 흔들어 행렬에서 해방하십시오. 블레이드 그룹을 풀어낸 후 유리 판에 장밋빛 면을 올려 놓고, 드라이 아이스를 스택 옆이나 위에 올려 놓고 시료를 더 쉽게 분리할 수 있습니다.
그런 다음 날카로운 가장자리로 스택을 놓고 엄지와 손가락 사이의 스택을 이동하여 블레이드를 분리합니다. 유리 판의 단면을 로스트랄에서 caudal으로 정렬하고 손가락 사이를 구부리거나 두 번째 차가운 블레이드로 분리하여 블레이드에서 조직을 분리합니다. 때때로, 조직은 칼날의 양쪽에 충실할 수 있고 소달 오리엔테이션에 장밋을 유지하기 위하여 주의해야 합니다.
해부를 시작하기 전에, 알렌 마우스 뇌 아틀라스 또는 다른 참조를 열고 관심 영역을 식별하는 데 필요한 랜드 마크를 찾을 수 있습니다. 차가운 집게 나 블레이드를 사용하여 섹션을 뒤집습니다. 또한 관심 영역이 섹션 전체에 걸쳐 일관성이 있는지 확인합니다.
깨끗한 메스나 펀치로 단면으로 잘라내어 금속을 부드럽게 밀어 넣습니다. 컷을 만들기 위해 앞뒤로 흔들어. 관심 있는 지역을 수확한 후, 미리 냉각된 1.5mm 튜브에 넣고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
조직을 처리하려면, 단백질 추출을 위한 차가운 RIPA 버퍼 또는 RNA 추출을 위한 용매를 포함하는 guanidinium을 추가하고 유리 다운 또는 기계균질화로 즉시 균질화하십시오. 이러한 방법을 검증하기 위해, 내측 전두엽 피질은 성인 CD-1 야생형 남성 마우스로부터 수집되었고, RNA 및 단백질이 특징이었다. 모세관 전기포고증으로 분석될 때, 열화된 RNA는 28S와 18S 리보소말 대역의 강도에 있는 손실뿐만 아니라 25와 200뉴클레오티드 사이의 얼룩을 표시합니다.
고품질 RNA는 낮은 분자량 영역에서 거의 또는 전혀 신호를 뚜렷한 리보소말 밴드를 보여줍니다. 냉동 해부 방법을 사용하여 얻은 RNA는 갓 수확된 조직에서 제조된 RNA와 비교하였다. 두 방법 모두 높은 무결성 수와 강한 리보소말 밴딩RNA를 생성합니다.
이 방법이 나중에 분석을 위해 해부된 조직의 미세 환경을 보존하는 데 사용될 수 있는지 확인하기 위해 RNA는 몇 주 동안 저장되었던 해부된 내측 전두엽 피질로부터 추출되었다. 모든 샘플은 8개 이상의 뚜렷한 리보소말 밴딩 및 RNA 무결성 번호를 가진 고품질 RNA를 생산했습니다. 냉동 해부 시료의 단백질 무결성을 확인하기 위해 단백질을 수집하여 높은 분자량 표적 KCC2에 대한 항체를 가진 니트로셀룰로오스 및 프로브로 이송되었으며, 저분자 단백질 액틴을 하였다.
모든 경우에 밴드는 눈에 띄는 고장 제품없이 날카롭고 뚜렷했다. 이 섹션의 미세 환경을 보존하고 뇌 아틀라스 이미지와 비교섹션 형태를 유지하기 때문에 프로세스 전반에 걸쳐 조직을 동결 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 방식으로 수집된 관심 영역은 음의 80도에서 몇 달 동안 저장될 수 있으며 RT-qPCR, RNA-Seq, 서부 블롯 분석 및 HPLC를 포함한 많은 다운스트림 응용 분야에서 활용할 수 있습니다.
이 방법은 THC 및 기타 카나비노이드에 노출 된 주산기 설치류의 변연 시스템 내에서 분자 변화를 탐구하는 데 사용되어 이러한 약물이 뇌 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 더 잘 이해합니다.
