Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten. Da Hirnregionen durch Sezieren von der Ernte eingefroren werden, bleiben Zielmoleküle erhalten und der Forscher hat Zeit, Interessengebiete sorgfältig zu sezieren und zu speichern. Die Identifizierung von Interessengebieten kann zunächst eine Herausforderung sein.
Die Verwendung gemeinsamer Hirn-Landmarken, wenn sie entstehen und sich durch die Abschnitte in Bezug auf die gewünschten Regionen zurückziehen, wird die Identifizierung deutlich machen. Nach dem Entfernen von Gehirnen von eingeschläferten erwachsenen CD-1 Wildtyp Mäuse, Blitz einfrieren das Gewebe für 60 Sekunden entweder in flüssigem Stickstoff oder Isopentan. Mit Trockeneis vorkühlen und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren.
24 Stunden vor der Zerkleinerung des Gewebes, legen Sie eine saubere Gehirnmatrix auf einen Stapel von aufgetauten Gefrierpackungen. Und die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierpackungen einstecken, um sicherzustellen, dass etwa einen halben Zentimeter zwischen dem Boden der Rasierschlitze und der Oberseite der Packungen. Richten Sie eine gefrorene Glasplatte für die Zerlegung ein, indem Sie eine isolierte Kiste mit Eis bis etwa fünf Zentimeter von oben füllen.
Dann legen Sie eine 2,5 Zentimeter Schicht Trockeneis auf die Oberseite. Und bedecken Sie es mit schwarzen Kunststofffolien. Legen Sie eine Glasplatte auf den Kunststoff.
Und Trockeneis um die Grenzen der Platte. Entfernen Sie die eingefrorene Gehirnmatrix aus dem Gefrierschrank und setzen Sie das Gehirn, KortexSeite nach oben, in die Matrix ein. Lassen Sie das Gewebe 10 Minuten lang auf die Temperatur in der Box ausdemieren.
Halten Sie den Deckel während dieser Zeit offen. Verwenden Sie kalte Zangen, um die Position des Gehirns in der Matrix so einzustellen, dass sich der sagittale Sinus und die Quersinus mit den senkrechten Rillen des Blocks anstellen. Sobald das Gehirn in Position ist, legen Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe ihres Zentrums und drücken Sie sie etwa einen Millimeter in das Gewebe.
Als nächstes legen Sie eine gekühlte Klinge an jedem Ende des Gehirns und drücken Sie den ganzen Weg nach unten in die Matrix. Dann beginnen Sie, gekühlte Klingen am rostralen Ende hinzuzufügen, legen Sie sie in die Schlitze nacheinander und drücken Sie sie sanft einen Millimeter in das Gewebe. Fügen Sie die Klingen in Intervallen von einem Millimeter hinzu und arbeiten Sie auf das kaudale Ende hin.
Wenn alle Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie oben mit Fingern, Handfläche oder einem stumpfen Objekt nach unten und schaukeln Sie sie langsam von Seite zu Seite, um sie durch das Gewebe zu bewegen. Sobald die Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, greifen Sie jede Seite der Gruppe von Klingen und befreien Sie sie von der Matrix, indem Sie hin und her schaukeln. Nach dem Befreien der Gruppe von Klingen legen Sie sie rostralSeite auf der Glasplatte, und legen Sie Trockeneis neben oder auf dem Stapel, um die Proben für eine einfachere Trennung weiter einzufrieren.
Platzieren Sie dann den Stapel mit scharfen Kanten nach unten und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Fingern verschieben. Richten Sie den Abschnitt auf den Glasplatten von rostral zu kaudal aus und trennen Sie das Gewebe von den Klingen, indem Sie sie zwischen den Fingern biegen oder sie mit einer zweiten gekühlten Klinge trennen. Manchmal kann Gewebe auf beiden Seiten einer Klinge kleben und es muss darauf geachtet werden, dass die rostrale bis kaudale Ausrichtung erhalten bleibt.
Bevor Sie mit der Sezierung beginnen, öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz, und finden Sie die Markierungspunkte, die erforderlich sind, um Interessengebiete zu identifizieren. Verwenden Sie gekühlte Zangen oder Klingen, um den Abschnitt umzudrehen. Und stellen Sie sicher, dass die Region von Interesse konsistent ist in diesem Abschnitt.
Schneiden Sie den Abschnitt mit einem sauberen Skalpell oder einem Schlag ein und schieben Sie das Metall sanft, aber fest in das Gewebe. Schaukeln Sie es hin und her, um den Schnitt zu machen. Nach der Ernte der Interessenregion in markierte vorgekühlte 1,5-Millimeter-Rohre geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Um das Gewebe zu verarbeiten, fügen Sie kalten RIPA-Puffer für die Proteinextraktion oder ein Guanidinium-haltiges Lösungsmittel für die RNA-Extraktion hinzu und homogenisieren Es sofort mit einem Glas-Downs oder mechanischem Homogenisator. Um diese Methode zu validieren, wurde der mediale präfrontale Kortex von erwachsenen CD-1-Wild-Typ-Männchenmäusen gesammelt und RNA und Protein charakterisiert. Bei der Analyse mit kapillarer Elektrophorese zeigt die degradierte RNA einen Verlust an Intensität der ribosomalen Bänder 28S und 18S sowie einen Abstrich zwischen 25 und 200 Nukleotiden.
Während hochwertige RNA deutliche ribosomale Bänder zeigt, gibt es im unteren Molekulargewicht kaum bis gar kein Signal. Die RNA-Gewinnung mit der gefrorenen Seziermethode wurde mit RNA aus frisch geerntetem Gewebe verglichen. Beide Methoden produzieren RNA mit hohen Integritätszahlen und starker ribosomaler Bandierung.
Um zu bestätigen, dass diese Methode verwendet werden kann, um die Mikroumgebung von seziertem Gewebe für spätere Analysen zu erhalten, wurde RNA aus seziertem medialen präfrontalen Kortex extrahiert, der über mehrere Wochen gespeichert worden war. Alle Proben produzierten hochwertige RNA mit ausgeprägten ribosomalen Bandierungen und RNA-Integritätsnummern über acht. Zur Bestätigung der Proteinintegrität der gefrorenen sezierten Proben wurde das Protein gesammelt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern gegen das hochmolekulare Ziel KCC2 und das niedermolekulare Protein Actin untersucht.
In allen Fällen waren die Bandbreiten scharf und unterschiedlich, ohne erkennbare Aufschlüsselungsprodukte. Es ist wichtig, das Gewebe während des gesamten Prozesses eingefroren zu halten, da dies die Mikroumgebung der Abschnitte bewahrt und die Sektionsmorphologie für den Vergleich mit Gehirnatlasbildern aufrechterhält. Auf diese Weise gesammelte Interessengebiete können für mehrere Monate bei negativen 80 Grad Celsius gespeichert und in vielen nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich RT-qPCR, RNA-Seq, Western Blot Analysis und HPLC.
Diese Methode wurde verwendet, um molekulare Veränderungen innerhalb der limbischen Systeme von perinatalen Nagetieren, die THC und anderen Cannabinoiden ausgesetzt sind, zu erforschen, um besser zu verstehen, wie diese Medikamente die Entwicklung des Gehirns beeinflussen können.
