מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה מאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון המולקולרי של אנגיוגנזה כלילת מחוץ לאורגניזם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מודלים במדויק את התהליך של אנגיוגנזה כליילי בתוך אורגניזם, להקל על המחקר של המנגנונים של אנגיוגנזה כליילית. התחל על ידי ריסוס עכבר בהריון נושא עוברי יום 11.5 עוברים עם 70% אתנול.

מרים את העור על הבטן עם ממטרים, להשתמש במספריים כדי להפוך את עור הבטן חתך צנית באופן כללי ו anteriorly עד הסרעפת כדי לחשוף את קרן הרחם. אוחז ברחם, חותך את הרקמה בחופשיות ושולף את קרן הרחם. מניחים את מחרוזת העוברים לתוך PBS סטרילי קר כקרח תחת מיקרוסקופ סטריאו, לקלף את שריר הרחם, שקי חלמון, וכיסוי amnion מכל עובר.

כאשר כל עובר מבודד, השתמש בכף מחוררת כדי להעביר את הרקמות לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה PBS סטרילי על קרח. כדי לקצור את רקמת הלב העוברית, להעביר את העובר הראשון להיות ניתחו לתוך צלחת פטרי חדשה מתחת למיקרוסקופ, ולמקום את העובר בצד הגחוני למעלה. השתמש מדפים עדינים לעשות חתך קטן בחזה, מעט מעל הסרעפת, ולהכניס את המדפים סגורים לתוך החתך כדי להגדיל את החתך.

באמצעות המקלעות להחזיק את קיר החזה פתוח כדי לחשוף את הלב והריאות, להשתמש בזוג השני של ממטרים כדי להזיז בעדינות את הלב לפני 90 מעלות כדי לחשוף את כאב הלב הגבי ואת וריד. לאחר מכן, תופסים את כלי הדם האלה בבסיס הלב, מושכים בזהירות את הלב והריאות בזהירות ושטיפת הרקמות עם PBS קר. כאשר כל רקמת הלב נקצרה, מניחים את דגימות הלב מתחת למיקרוסקופ ומסירים את האונות הריאה מכל לב.

לכוון את הלב הראשון על הצד הגבי שלה, והחזקת הלב בבסיסו, להשתמש מטלפים עדין כדי לגרד את האטריה שמאלה ויימין ברקמה הסמוכה המקיפה את SV מהלב. כדי לבודד את SV, לכוון את הצד הגבי הלב למעלה. בזהירות להסיר את SV מהלב ולהשתמש פיפטה העברה סטרילית למקם את הרקמה המבודדת לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטר חדש המכיל קרח קר סטרילי PBS על קרח.

כדי לבודד את כל החדרים, להסיר את דרכי הזרימה ולהשתמש פיפטה העברה סטרילית חדשה למקם את החדרים לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטרים נפרדים המכיל PBS סטרילי קר קרח על קרח. כדי להקים SV ותרבויות חדר שלם, ראשית לצפות את הממברנות של אחד שמונה מיקרומטר נקבובית תרבות PET להוסיף לגם של צלחת תרבות 24 באר, עם 100 microliters של מטריצה חוץ תאית מדולל טרי לכל תרבות לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר המטריצה התגבשה, השתמש בפיפיט העברה כדי להעביר הסבר אחד לכל הכנס, והזז את הלוחית מתחת למיקרוסקופ.

באמצעות מדפים נקיים, למקם את explants במרכז כל הכנס כדי להבטיח כי הם אינם מחוברים לקירות הצדדיים, בזהירות להסיר כל PBS נוסף. לאחר מכן, להעביר את הצלחת עם המכסה סגור תחת מכסה המנוע תרבות רקמת זרימה למינארית, ולהוסיף 100 microliters של מדיום מלא מחומם מראש לכל הכנס, ו 200 microliters לבאר מתחת לכל הכנס. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של PBS לבירות שאינן שימוש, והמקמים את הצלחת בחמה לתרבות התאים למשך חמישה ימים.

לטיפול VEGF-A ביום השני של התרבות, הסר את המדיום משני התאים של כל תרבות והוסף 100 מיקרוליטרים של PBS לכל הכנסה, ו -200 מיקרוליטרים של PBS לכל באר. לאחר מערבולת הצלחת כמה פעמים, להחליף את PBS עם 300 microliters של מדיום בסיס בתוספת 1% סרום בקר עוברי להתחיל את התרבויות, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור. ביום השלישי לאחר רעב, להוסיף 300 microliters של מדיום בסיס טרי בתוספת סרום לבירות הבקרה ואת המדיום הבסיסי בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר של VEGF-A לבירות הטיפול, ולהחזיר את הצלחת לחממת תרבות התא.

ביום השישי של התרבות, לשטוף את התאים עם PBS כפי שהוכח, ולתקן את התרבויות עם 200 microliters של 4% paraformaldehyde בכל באר, ו 100 microliters של קיבוע בכל הכנס. לאחר 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה, לשטוף את התרבויות עם 300 microliters של PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף עם נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני ל הבארות ומכניסים לתרבות לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה.

למחרת בבוקר, לשטוף את התרבויות 10 פעמים פעילי שטח שאינם יוניים ב PBS עם נדנדה, שינוי פתרון לשטוף כל 10 דקות לפני תיוג התרבויות עם 300 microliters של נוגדן משני פלואורופור מתאים גדוש בארבע מעלות צלזיוס לילה עם נדנדה. למחרת, לשטוף את התרבויות 10 פעמים PBS טרי עם פעילי שטח שאינם יוניים כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש במקלפים עדין כדי לקלף בזהירות את הממברנה מכל הכנס ולהציב את הממברנות על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית בודדות, צד explant למעלה.

מכסים את הדגימות עם אמצעי הרכבה בתוספת DAPI בפתק כיסוי, וחותמים את הקצוות של מחליקי הכיסוי עם לק ציפורניים ברור. כאשר לק הציפורן התייבש, תמונה השקופיות על ידי מיקרוסקופיה confocal. כאשר תאי SV ראשוניים גדלים על החדר הלב, הם מפסיקים לייצר סמנים הווריה כגון Coup-TF2.

לאחר חמישה ימים של תרבות, תאי אנדותל SV לנבוט לנדוד על הממברנה. כמו בלב העוברי, ביטוי Coup-TF2 מצטמצם ככל שהספינות נודדות הרחק מה-SV. תרבויות מגורה עם VEGF-A התערוכה צמיחה מוגברת של נבטים אנגיוגניים הן בצפיפות והן באורך. תרבויות SV נוספות מגורה על ידי VEGF-A להפגין עלייה כמעט פי שלושה אורך נבטים לעומת פקדים, מה שמרמז כי נבטים אנדותל מ SV ו אנדוקרדיום להגיב VEGF-A.

חשוב לא לאבד את רקמת ה-SV תוך משיכת הלב והריאות, הסרת האטריה וניקוי הרקמה הסמוכה המקיפה את ה-SV. ניתן לבצע ניסויי הדמיה חיה כדי לדמיין אנגיוגנזה כלימית וללכוד את הפרטים של הדינמיקה התאית והמולקולרית במהלך התהליך. טכניקה זו שימושית ביותר להערכת מנגנונים מולקולריים פוטנציאליים של אנגיוגנזה כלילת וכמערכת מודל לחקר אנגיוגנזה באופן כללי.