מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקים בסיוע למחקר מדעי 17H05661 ו 18K19903, Core-2-core תוכנית, ומעבר AI המכון.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

במסגרת פרוטוקול זה, פטנט כבר מורשה Jiksak Bioengineering, Inc. אשר נוסדה על ידי ג'ירו קוואדה.

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של אורגנואיד עצב מוטורי (MNO) אשר יש צרור אקסון המורחבת מספרואיד נוירון מוטורי שנוצר מתאי iPS אנושיים. צרור האקסון שנוצר הוא עבה, גמיש ומאורגן היטב במבנים חד-כיווניים. על ידי ניתוח צרור האקסון, ניתן להשיג חלבון אקסונלי ו- RNA בטוהר גבוה מספיק לניתוחים ביוכימיים. פעילות עצבית ניתן למדוד בחבילות אקסון וספרואידים עם הדמיית סידן. זיהום של חלבונים גרעיניים ודנדריטיים בליסט האקסונלי לא זוהה על ידי סופג מערבי, והוכיח שהשיטה שלנו הפרידה ביעילות אקסונים מגופי תאים ודנדריטים.
אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא בידול מהיר ויצירת MNO מצויד צרור אקסון, שבו כל התהליכים יכולים להיעשות ב 4 שבועות עם פרוטוקול 3D ו 5-6 שבועות באמצעות פרוטוקול 2D. זה קצר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים אשר בדרך כלל לקחת 3-4 שבועות פשוט להבדיל לתוך MN מתאי גזע עובריים ותאי iPS17 וזה לוקח 2-4 שבועות נוספים כדי לקבל התארכות אקסון. פרוטוקול תלת-ממד מועדף בדרך כלל על-פני פרוטוקול דו-ממדי בשל זמן הבידול הקצר יותר, פחות שלבים והסיכונים הטכניים המופחתים ללא שלב הניתוק בהשוואה לפרוטוקול הדו-ממדי. שבב תרבות הרקמה המבוסס על מיקרופלואידים תוכנן באופן כך שהאקסונים של MNS יוכלו להאריך לכיוון התא השני דרך המיקרו-שאנל, המאפשר היווצרות צרור של אקסונים על ידי גרימת אינטראקציות אקסו-אקסונליות וזיקה בין אקסונים. בגלל ההגדרה הניסיונית הפשוטה, כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להתבצע לא רק על ידי ביו-הנדסה, המכירים את המניפולציה של שבב תרבות רקמות, אלא גם ביולוגים וחוקרי מוח שאינם מכירים מיקרופלואידים וטכניקות מיקרו-פיבריקציה. יש לציין כי שלבים 1 ו- 2 יכולים להתבצע גם באמצעות שירות ייצור חיצוני.
אחד הצעדים הקריטיים להשגת הפרוטוקול הוא שינוי רציף של מדיום תרבותי. מומלץ לשנות לחלוטין את מדיום התרבות בכל שלב במהלך הבידול, כך שגורמים במדיום המושקע לא יפריעו לבידול MN. נקודה קריטית נוספת של פרוטוקול זה היא לשמור על תאי iPS מובחנים באיכות טובה. איכות תרבות התאים הראשונית של iPS משפיעה באופן משמעותי על היעילות להשגת נוירונים מוטוריים ו- MNO. נקודה נוספת היא כי הקוטר של MNS צריך להיות קטן יותר מגודל החור של השבב (1.5 מ"מ). ספרואידים גדולים יותר אינם יכולים להיכנס לתא, ועלולים לחוות נמק היפוקסי חמור בחלק המרכזי. ניתן לשלוט בגודל של MNSs על ידי שינוי מספר זריעה ראשוני של תאי iPS (בפרוטוקול 3D) או נוירונים מוטוריים (בפרוטוקול דו-ממדי). יש למטב את צפיפות הזריעה של תאים עבור כל קו תא iPS.
מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים עם מיקרוגרובים ומסנני נקבוביות קטנים שימשו באופן נרחב להפרדת אקסונים מגופי תאים ודנדריטים. טכניקה זו יכולה גם להפריד אקסונים מגופי תאים ודנדריט, עם שפע מעולה של אקסונים ברקמות ארוזות. בהשוואה לשיטות אחרות, מגבלה מרכזית אחת של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה להפריד בין שתי מדיה תרבותית שונה בעיצוב הנוכחי של שבב תרבות הרקמה, המעכב את היכולת של תרבות משותפת של שני תאים שונים הדורשים שתי מדיה נפרדת. מגבלה נוספת היא כי שבב PDMS לשים הגבלה קבועה מראש על גודל הרקמה. ספרואיד גדול יותר מהחור לא יכול להיכנס לתא, וחבילת האקסון לא יכולה להיות עבה יותר מרוחב הערוץ המיקרופלואידי.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים של נוירונים. הקבוצה שלנו הראתה יכולת מודל של מערכת מוחית באמצעות שיטה שונה בשילוב עם טכניקות אורגנואיד מוחי18. ספירואידים קליפת המוח הוכנסו לשני התאים והאקסונים התארכו באופן ספונטני הדדית לכיוון כל ספרואיד, ולאחר מכן צרור אקסון נוצר באופן ספונטני. כתוצאה מכך, ניתן לחבר שני כדוריות קליפת המוח באמצעות צרור אקסון, ואת הרקמה ניתן להשיג כחתיכה אחת. זה מדגים כי הגישה היא מאוד תכליתי כדי ליצור רקמות צרור אקסון ללא קשר לסוגי תאים עצביים. בפרוטוקול זה, תאי iPS אנושיים שימשו, עם זאת, תאי גזע אחרים כולל תאי ES אנושיים ותאי גזע עצביים אנושיים עשויים לשמש עם שינויים בפרוטוקול המוצג. 3D spheroids של נוירונים יכול להיווצר על ידי פרוטוקולים מגוונים19,20. שיטה זו של ביצוע רקמות עם צרור אקסון יכול להיות משולב בעתיד עם פרוטוקולי בידול אחרים להכנת כדורי MN 3D. בנוסף, עובי ואורך צרור האקסון ניתן לשלוט פשוט על ידי שינוי הרוחב והגובה של microchannels של שבב תרבות הרקמה להתפתחויות עתידיות.
אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים שבבסיס הפיתוח והמחלות של fascicles אקסון.

נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה (MN) מרחיבים את האקסונים לשרירי השלד כדי לשלוט בתנועת הגוף. המסלולים האקסונליים שלהם מאורגנים ומוסדרים מאוד בתהליך ההתפתחותי. למרות מחקרים רבים על הארכת אקסון והדרכה1, מנגנונים להיווצרות צרור אקסון מאורגן עדיין תחת חקירה. אקסונים של נוירונים מוטוריים נפגעים לעתים קרובות על ידי מחלות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)2, אבל מנגנונים פתופיזיולוגיים של הנזק על fascicles אקסון מובנים היטב. לפיכך, מודל פיזיולוגי ופתולוגי לסיכום היווצרות צרור אקסון ורגרסיה נדרש בתחום.
נוירון מוטורי שמקורו בתאי גזע אנושיים הוא פלטפורמה מבטיחה להבנת ההתפתחות והמחלות כגון ALS3. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (תאי iPS) יכולים לשמש למודל מחלות באמצעות תאים שמקורם בחולה. עד כה, שיטות בידול שונות מתאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך MN דווחו4,5,6. עם זאת, אקסונים של נוירונים בתרבות דו מימדית מכוונים באופן אקראי ואינם מסכמים מחדש במיקרו-ווירון vivo בתוך עצבים מתפתחים שבהם אקסונים מורכבים באופן חד כיווני באמצעות אינטראקציות אקסו-אקסונליות צפופות7. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו טכניקה ליצירת רקמה תלת מימדית הדומה לעצב מוטורי מתאי iPS אנושיים8, וקראנו לרקמה אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO). MNO מורכב מגופי תאים הממוקמים בספרואיד נוירון מוטורי (MNS) ו fascicle אקסונלי המורחבת מן הכדוריד. האקסונים ב fascicle הם בעלי אוריינטציה חד כיוונית, אשר דומה אקסונים בפיתוח עצבים מוטוריים. לפיכך, MNOs באופן ייחודי לספק microenvironment אקסונלי פיזיולוגי, אשר לא נעשה על ידי כל שיטות אחרות שפותחו בעבר תרבות עצבית.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לייצור שבבי תרבית רקמות, התמיינות נוירון מוטורי מהירה, היווצרות אורגנואיד עצב מוטורי בשבבים מפותחים. שבב תרבית הרקמות שלנו הוא פשוט מאוד, והוא מכיל רק תא לקבלת ספרואיד, מיקרו-שאנל ליצירת צרור אקסון, ותא לדיור מסופי אקסון. המכשיר אינו מכיל מבנים מורכבים כולל microgrooves או מסנני micropore המשמשים לעתיםקרובותכדי להפריד אקסונים וגופי תאים לפי גודל 9,10. לפיכך המכשירים שלנו ניתן לפברק בקלות על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה אם הגדרת פוטוליטוגרפיה זמין.
בידול מהיר של תאי iPS אנושיים מושגת עם שילוב ממוטב של גורמי גרימת ודוגמת (SB431542, LDN-193189, חומצה רטינואית (RA), אגוניסט החלקה (SAG)) וגורמי תאוצה (SU5402 ו- DAPT). דווח כי השילוב של SU5402 ו- DAPT מאיץ את הבידול של נוירונים היקפיים ותאי ציצה עצביים11. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שלוש שיטות שונות ליצירת MNOs, כך שהקוראים יוכלו להחליט על שיטה המתאימה ביותר לצרכיהם. אנו ממליצים לבצע בידול של תאי iPS אנושיים לאחר יצירת ספרואיד (שיטת 3D), שכן MNS מובחן יכול להיות מועבר ישירות לתוך שבב תרבית רקמה. לחלופין, תאי iPS אנושיים יכולים להיות מובחנים לתוך נוירונים מוטוריים בתרבות monolayer (2D), ולאחר מכן נוצר לתוך כדורי נוירון מוטורי תלת מימדי כפי שדיווחנו בעבר8. עדכנו את הפרוטוקול, ועם שיטת הבידול התלת מימדית המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן להימנע מהמעבר מד"ד לתלת-ממד וניתן להשיג MNOs עם זמן בידול קצר יותר, פחות שלבים וסיכונים טכניים מופחתים ללא שלב הניתוק. נוירונים זמינים מסחרית יכולים לשמש גם כדי ליצור MNS כדי להפחית את הזמן עבור בידול.
כדי ליצור MNO, אנחנו תרבותיים MNS בשבב תרבות הרקמות. האקסונים מתעלים מהספרואיד ומתרחבים למיקרו-שנל שבו האקסונים מתאספים ומתיישרים באופן חד-כיווני. זה מקל על אינטראקציה אקסו-אקסונלית והיווצרות ספונטנית של רקמת צרור חד כיוונית מורכבת היטב של אקסונים במיקרו-שאנל, אשר מושגת באופן ייחודי על ידי פרוטוקול זה, ואילו היווצרות צרור ספונטני או אוריינטציה אקסונית מודרכת לבדה יכולה להיות מושגת על ידי פרוטוקולים אחרים12,13,14. בניסוי טיפוסי, תאים מעטים נודדים מספרואידים למיקרו-שנל ורוב התאים נשארים ספרואידים סמוכים. שיטה זו מאפשרת להפריד אקסונים באופן ספונטני מהספרואידים מבלי להשתמש במחסומים פיזיים תלויי גודל (למשל, מיקרוגרובים או מסנני מיקרופור) כדי להפריד אקסונים מגופי תאים.
MNO וכתוצאה מכך יכול להיות נתון לבדיקות שונות, כולל ניתוחים מורפולוגיים, ביוכימיים ופיזיים. גוף התא וחבילת האקסון המורחבת יכולים להיות מבודדים פיזית על ידי חיתוך וניתן לנתח אותם בנפרד לניסויים במורד הזרם, למשל, מבחנים ביוכימיים. חומרים ביולוגיים כולל RNA וחלבון ניתן לבודד רק כמה חבילות אקסון עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כולל RT-PCR ו סופג המערבי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד עצבי מוטורי מתאי iPS, המציע מודל פיזיולוגי ופתולוגי אטרקטיבי לחקר המנגנון שבבסיס ההתפתחות והמחלה של שרירי האקסון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

צואה של אקסונים היא אחד המוטיבים המבניים העיקריים שנצפו במערכת העצבים. שיבוש של fascicles אקסון יכול לגרום למחלות התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. למרות מחקרים רבים של אקסונים נערכו, ההבנה שלנו של היווצרות ותפקוד לקוי של fascicles אקסון עדיין מוגבל בשל היעדר מודלים תלת מימדיים חזקים במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לדור המהיר של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPS) הנגרמים על ידי בני אדם בשבב תרבות רקמות מבוסס מיקרופלואידי. ראשית, ייצור שבבים המשמשים לשיטה מתואר. מתאי iPS אנושיים, נוצר ספרואיד נוירון מוטורי (MNS). לאחר מכן, מערכת ה-MNS המבודלת מועברת לשבב. לאחר מכן, האקסונים גדלים באופן ספונטני מתוך הכדורית ומתכנסים לתוך שקע בתוך מיקרו-שנל המצויד בשבב, אשר מייצר רקמת MNO הנושאת צרור של אקסונים המורחבים מהספרואיד. לניתוח במורד הזרם, ניתן להוציא MNOs מהשבב כדי להיות קבוע לניתוחים מורפולוגיים או לנתח ניתוחים ביוכימיים, כמו גם הדמיית סידן והקלטות מערך רב אלקטרודות. MNOs שנוצר עם פרוטוקול זה יכול להקל על בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים הבסיסית פיתוח ומחלות של fascicles אקסון.

נוירונים מוטוריים נבדלו תוך 12-14 ימים בהליכי בידול תלת-ממדיים (איור 4 ואיור 5). חשוב לציין, יותר מ 60% מהתאים הביעו סמן נוירון מוטורי HB9 במהלך הבידול. אימונוהיסטוכימיה גילתה שכ-80% מהתאים במערכת העצבים החוץ-ארגונית היו נוירונים מוטוריים חיוביים SMI32. HB9 ו SMI32 הם הוקמה בשלב מוקדם נוירון מנוע סמנים15,16. הביטוי של HB9 ו- SMI32 הם הפרמטרים העיקריים שיש לאשר כדי להבטיח זהות תאית של נוירונים מוטוריים. לאחר כניסתה של MNS לתוך שבב התרבות, אקסונים להרחיב לתוך הערוץ ואת צורות צרור אקסון. בשל מיקרו-ערוצים המשמשים כמדריכים פיזיים, האקסונים מתעלים מה-MNS ויוצרים חבילה באמצעות אינטראקציה אקסו-אקסונלית(איור 6A). זה חיוני כדי לאשר את היווצרות צרור האקסון על ידי תצפית מיקרוסקופית כדי לאשר את הדור של MNO. MNO מוצלח נושא צרור אקסון רחב יותר מ 50 מיקרומטר וכמה אקסונים מבודדים מתוך החבילה בערוץ. התארכות ראשונית של אקסונים ניתן לראות 24 שעות לאחר כניסתה של ספרואיד. בתוך 3-4 הימים הבאים, האקסונים הגיעו למרכז המיקרו-שנל ואז מגיעים לקצה השני תוך 10 ימים נוספים(איור 6A). כתוצאה מכך, האקסונים התאספו ויצרו צרור ישר וחד כיווני ב 2-3 שבועות בשבב, ופעילויות עצביות נצפו לאחר מכן.
ניתן לאסוף אורגנואידים של עצבים מוטוריים מהשבב על ידי ניתוק ה- PDMS מזכוכית המיקרוסקופ לצורך ניתוח ביולוגי (איור 6B). ניתן לנתח ולבודד חבילות אקסון וגופי תאים באמצעות חיתוך באמצעות סכין כירורגית או פינצטה מתחת למיקרוסקופ (איור 6B). חומרים ביולוגיים אלה כולל RNA וחלבון יכולים לשמש עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כגון RT-PCR ו סופג המערבי. בחבילות אקסון של MNOs, חלבונים גרעיניים או יצרנים דנדריטיים אינם מזוהים בנפח המערבי(איור 6C).
בשילוב עם מחוון סידן (Fluo-4 AM), פעילות עצבית ניתן ללכוד שבב תרבות הרקמה. פעילות ספונטנית של נוירונים מוטוריים בספרואיד ובחבילת האקסון נצפתה בתוך MNO. כמו כן, הפעילויות העצביות נצפו באמצעות מערכת מערך רב אלקטרודה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> איור 1: הממד של שבב תרבות הרקמות PDMS. (A)פוטומסק של שבב תרבות הרקמות. (B)מידות של מיקרו-שנל בשבב תרבית הרקמות. קוטר תא הבסיס להחזקת ספרואיד נוירון מוטורי הוא 2 מ"מ והחור של PDMS מעל התא הוא 1.5 מ"מ. הרוחב והגובה של מיקרו-שאנל המגשר בין שני תאים הם שניהם 150 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> איור 2: איור סכמטי של בידול נוירונים מוטוריים. (A) צעדי הבידול כללו אינדוקציה עצבית, דפוס לתוך שושלת נוירון מוטורי, והתבגרות של נוירונים מוטוריים. (B)שתי אפשרויות ליצירת ספירואיד נוירון מוטורי (MNS) מתאי iPS: פרוטוקול תלת-ממד, ופרוטוקול דו-ממדי עם שלב הניתוק של נוירונים מוטוריים. אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) ניתן להשיג על ידי שני הפרוטוקולים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> איור 3: פרוטוקול צעד אחר צעד לציפוי מטריצת קרום מרתף והצגת כדוריות של נוירונים מוטוריים. (A)ציפוי מטריצת קרום מרתף בערוץ של שבב תרבות הרקמות. (B)כניסת MNS לתוך החור של השבב. (ג)שינוי תרבותי בינוני על ידי שאיפה של מדיום מותש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> איור 4: בידול בין נוירונים מוטוריים דו-ממדיים ותל-ממדיים. (A)קורס זמן של בידול MNS תלת-ממדי מייצג (פרוטוקול תלת-ממד). גודלו של מערכת העצבים המרכזית גדל בהדרגה עם הזמן. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ב) משך זמן של בידול דו-ממדי ב- -D2, D0, D1, D6, D12 (פרוטוקול דו-ממדי). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> איור 5: אפיון של נוירונים מוטוריים. (A)(משמאל) הקפאה של מערכת MNS מוכתמת בנוגדן SMI-32 וב-DAPI. (אמצע) אני לא יכול לעשות את זה. תמונת ניגודיות פאזה של מערכת MNS שהושלכה מחדש על משטח מצופה מטריצת ממברנה במרתף. התארכות אקסונלית נצפתה. (מימין) אני לא יכול לעשות את זה. אקסונים של MNS replated מוכתם נוגדנים סינפסין I ו Tuj1. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר (שמאל ואמצע) ו 50μm (ימין). (B)תמונה מייצגת של נוירונים מוטוריים דו-מימדיים עם נוגדני Tuj ו- HB9. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> איור 6: אפיון אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) שנוצר בשבב תרבות. (A)תמונות מייצגות של התארכות אקסון והיווצרות צרור אקסון עבה על D32. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B)חיסון של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) על ידי SMI-32 ו- DAPI. אקסונים וגופי תאים יכולים להיות מבודדים על ידי חיתוך פיזי. סרגל סולם: 1 מ"מ. (C) טוהר החלבון מאקסונים וגופי תאים מכמתים על ידי סופג מערבי. MAP2, סמן דנדריטי, לא זוהה בחלבון אקסונלי, ואילו סמן אקסונלי Tau1 מועשר בחלבון האקסונלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  The University of Tokyo. פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.

Video: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

סיבים חיבורים של אזור המשלים המשולב Revisited: מתודולוגיה של פיזור דיסק, DTI, ו 3 תיעוד מימדי

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

מידול צורה תלת מימדי וניתוח מבני המוח

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...