המאפיינים הביומכניים של תאים ורקמות מווסתים את תפקודם וחיוניותם. AFM מאפשר כימות מוקדם של דלקת מפרקים ניוונית ברמה התאית המבוססת על מדידות גמישות. AFM מאפשרת רכישת מדידות ברמה התאית מבלי לפגוע בדגימה וברזולוציה גבוהה, אמינות ורגישות.
שינויים במאפיין הביומכני מתרחשים בשלב מוקדם של דלקת מפרקים ניוונית. מדידת הגמישות המקומית של סחוס פרקי מאפשרת להסיק מסקנות תקפות על מידת ניוון הרקמות המקומיות. כדי להעריך שינויים ניווניים בתוך מפרק הברך האנושית, השתמש תחילה באזמל כדי לחתוך את הסחוס המפרקי ככלל מהעצם התת-כולנדראלית ולהטביע את דגימת הסחוס במדיום הטבעה מסיס במים על ידית Cryotome המקפיאה בטמפרטורה נמוכה במכשיר Cryotome.
כאשר המדגם קפא, השתמש Cryotome סטנדרטי לרכוש 35 חלקים עבים מיקרומטר של רקמה מהשכבה העליונה ביותר של הסחוס המחשוף, איסוף כל קטע על מגלשות זכוכית בודדות. כאשר כל החלקים הושגו, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף כדי להסיר את מדיום הטבעה מסיס במים. הסר את השקופית הראשונה מהכביסה.
לאחר מכן, הוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של דבק מדגם תואם ביולוגית לכל קטע למנות פטרי בודדות תואמות AFM. הסר כל פתרון עודף מהדגימה ולחץ בעדינות על קצות החלק המיובש על כתמי הדבק. לאחר שתי דקות, מכסים בזהירות את הרקמות המוקשרות במדיום L-15 של ליבוביץ ללא L-גלוטמין ומציבים את הכלים ב חממה לתרבות התאים עד שיש לנתח את הדגימות.
כדי להכין את מכשיר ה-AFM, התאימו את גוש הגז למדידה בסביבה נוזלית במחזיק ה-AFM כך שהמשטח העליון מקביל למחזיק, ולהשתמש בפינצטה כדי להרכיב בזהירות את הקן שנבחר על פני השטח של בלוק הזכוכית, כך שטיפ ה-AFM עם המיקרוספרה בולט מעל המישור האופטי המלוטש. כדי לייצב את cantilever על בלוק הזכוכית, להחליק את הקפיץ המתכתי לתוך החריץ של הבלוק, ולהשתמש פינצטה כדי להדק את החלק העליון של cantilever עם המעיין. בזהירות למקם את בלוק הזכוכית עם cantilever על ראש AFM ולאבטח את הבלוק עם מנגנון הנעילה המשולב.
לאחר מכן הר את ראש AFM עם cantilever על המכשיר AFM עם האביב פונה שמאלה. כדי להרכיב את הדגימה על מכשיר AFM, מניחים את צלחת פטרי מדגם על מחזיק מדגם AFM ולהגדיר את תנור צלחת פטרי ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר כ- 20 דקות, פתח את תוכנת ההתקן ואת יישור הלייזר ואת חלונות הגדרת הפרמטרים של הגישה.
לאחר מכן, הפעל את מנוע הצעד, את אור הלייזר ואת מצלמת CCD ולהשתמש בפונקציית מנוע צעד כדי להוריד את cantilever ב 100 צעדים מיקרומטר עד cantilever שקוע לחלוטין במדיום. השתמש בברגים הכוונון כדי לכוון את הלייזר על גבי cantilever ולהשתמש ברגים התקן AFM כדי להתאים את קרן הלייזר, כך הקרן משתקף נופל על מרכז photodetector. לאחר שהלייזר הותאם, התאימו את הפוטודקטור לפי הצורך כדי להגדיר את אות הסכום לוולט אחד ומעלה ואת ההטיות הצדדיות והאנכיות קרוב לאפס.
כדי להשיג את עקומת כוח הכיול, הפעל גישת סורק עם פרמטרי הגישה כפי שמצוין בטבלה. לאחר התחתית של צלחת תרבות הרקמה הוא הגיע, לסגת cantilever על ידי 100 מיקרומטר. הגדר את פרמטרי הריצה כפי שצוין בטבלה.
ולחץ על הפעל כדי להתחיל מדידה ולקבל עקומת מרחק כוח כיול. עקומת הכוח מתקבלת כפי שמודגם באיור. בעקומות המרחק של כוח הכיול, בחר את האזור לקבלת התאמה ליניארית של העקומה הנשלפת.
לאחר התאמה ליניארית במקום, הערכים יישמרו על ידי התוכנה. לאחר מכן, כאשר המדידות מבוצעות במדיום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הגדר את משתנה הטמפרטורה בתוכנה ל-37 מעלות כדי לחקות את התנאים הפיזיולוגיים קרוב ככל האפשר. כדי לזהות את הדפוסים המשוחחים בקטעי דגימת הסחוס, אתר וזהה את הדפוסים התאיים הספציפיים של סחוס מפרקים מהברך האוסטיאוארטריטית במיקרוסקופ ניגוד הפאזה, אשר עשויים לכלול מחרוזות בודדות המעידות על אזורי רקמה בריאים, מיתרים כפולים המעידים על תחילת ניוון רקמות, אשכולות קטנים, שהם סימנים של ניוון רקמות מתקדם, ואשכולות גדולים, המעידים על הרס רקמות סוף השלב.
לאחר שזוהתה תבנית רצויה ספציפית, עבור מדידות מטריצה פריקלירית, מקם את ה- cantilever בסמיכות לתאים ולמדוד שני אתרים לכל תבנית שנבחרה לכל סוג מטריצה, תשע פעמים לכל אתר מדידה כולל גודל מדגם גדול מספיק כדי להסביר אי דיוקים אפשריים. התמקד במטריצה התאית של התבנית שיש למדוד ולתקן את עכבר המחשב בשלב זה. לאחר מכן, התמקד בבדיקה והזז את קצה הגשוש לנקודה שקודם לכן תוקנה על ידי חץ המחשב.
כדי לבצע מדידות של מטריצה חוץ תאית, בחר אזור ללא תאים כלשהם ולבצע גישה ואחריה נסיגה, כך cantilever ממוקם 100 מיקרומטר מעל הרקמה. לאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל את המידות, באמצעות הפרמטר setpoint המתקבל על-ידי כיול ה- cantilever. כדי לעבד את הנתונים שהושגו, פתח תוכנה לעיבוד נתונים התואמת לנתונים המתקבלים מהתקן AFM ובחר את מודל הרסט בתוכנה לעיבוד עקומות מרחק הכוח.
הגדר את יחס הפואסון ל- 0.5, את צורת הקצה כספירה ואת רדיוס הקצה ל- 12.5 מיקרומטר. לאחר שכל הפרמטרים יותאמו, התוצאות יותאמו ומודולוס של יאנג יחושב על ידי התוכנה. לאורך המודל הפיזיופתולוגי ממיתרים למחרוזת כפולה ומאשכולות קטנים עד גדולים, הן מודולי אלסטי מטריצה חוץ-תאית והן מודולי אלסטיים של מטריצה פריקלירית יורדים באופן משמעותי בין כל שינוי תבנית למעט בין מיתרים ומיתרים כפולים.
בנוסף, יחס המטריצה החוץ-תאית-פריקלולרית אינו משתנה באופן משמעותי, בעוד שנצפית ירידה ניכרת בהבדלים המוחלטים בגמישות בין מטריצות חוץ-תאיות למטריצה פריסלולרית. ערכי הגמישות תלויים בתנאים שונים כגון עומק הכניסה או מאפייני הקצה של cantilever. AFM ולכן מתאים ביותר להשוואת תנאים שונים בתוך אותה התקנה ניסיונית.
ככל שה-AFM מודד את הגמישות המקומית של המדגם, יש לתקן את הסעיפים במקום על מנת לאפשר מדידות מדויקות ולהימנע מנזקי ה-cantilever. כדי לנתח עוד יותר את התהליכים האחראים לשינויים בגמישות הרקמות, כימות ביוכימי של מבנה חלבונים מעניינים יכול להתבצע באמצעות כתמים מערביים או ELISAs.
