Биомеханические свойства клеток и тканей регулируют их функцию и жизнеспособность. AFM позволяет ранняя количественная оценка остеоартрита на клеточном уровне на основе измерений эластичности. AFM позволяет проводить измерения на клеточном уровне, не повреждая образец и с высоким разрешением, надежностью и чувствительностью.
Изменения биомеханического свойства происходят на ранних стадиях остеоартрита. Измерение местной эластичности суставного хряща позволяет сделать достоверные выводы о степени дегенерации местных тканей. Для оценки дегенеративных изменений в коленном суставе человека, сначала используйте скальпель, чтобы вырезать суставной хрящ в целом из субхондриальной кости и встроить образец хряща в водорастворимую встраивательную среду на ручке Cryotome, которая замерзает при низкой температуре в устройстве Cryotome.
Когда образец замерз, используйте стандартный Cryotome, чтобы приобрести 35 микрометров толщиной секций ткани из верхнего слоя суставного хряща, собирая каждый раздел на отдельные стеклянные слайды. Когда все разделы были получены, промыть образцы три раза в свежем PBS в течение пяти минут за стирку, чтобы удалить водорастворимые встраивания среды. Снимите первый слайд с стирки.
После этого добавьте две-три капли биосовместимого образца клея на секцию в отдельные блюда Петри, совместимые с AFM. Удалите излишки раствора из образца и аккуратно нажмите края высушенной секции на клеевых пятен. Через две минуты тщательно накройте кабенные ткани L-15 лейбовица без L-глутамина и поместите посуду в инкубатор клеточной культуры до тех пор, пока образцы не будут проанализированы.
Чтобы подготовить устройство AFM, отрегулируйте газовый блок для измерения в жидкой среде на держателе AFM, чтобы верхняя поверхность была параллельна держателю, и используйте пинцет, чтобы тщательно смонтировать выбранную кантилевер на поверхность стеклянного блока, так что наконечник AFM с микросферой выступает над полированной оптической плоскостью. Чтобы стабилизировать кантилевер на стеклянном блоке, сдвиньте металлическую пружину в канавку блока и используйте пинцет, чтобы зажать верхнюю часть кантилевера пружиной. Аккуратно поместите стеклянный блок с кантилевером на голову AFM и закрелите блок интегрированным механизмом блокировки.
Затем смонтировать голову AFM с кантилевером на устройство AFM с пружиной лицом влево. Чтобы смонтировать образец на устройстве AFM, поместите образец чашки Петри на держатель образца AFM и установите нагреватель чашки Петри до 37 градусов по Цельсию. Примерно через 20 минут откройте программное обеспечение устройства и лазерное выравнивание и подойдь к параметру, устанавливая окна.
Затем включите двигатель степпера, лазерный свет и камеру CCD и используйте функцию степпера двигателя, чтобы снизить кантилевер на 100 микрометров, пока кантилевер не будет полностью погружен в среду. Используйте винты регулировки, чтобы направить лазер поверх кантилевера и использовать винты устройства AFM для регулировки лазерного луча так, чтобы отраженный луч упал на центр фотодетектора. После того, как лазерная кантилевер была скорректирована, отрегулируйте фотодетектор по мере необходимости, чтобы установить сигнал суммы до одного вольта или выше, а боковое и вертикальное отклонение близко к нулю.
Чтобы получить кривую силы калибровки, запустите подход сканера с параметрами подхода, указанными в таблице. Как только дно ткани культуры блюдо достигнуто, втягивать кантилевер на 100 микрометров. Настройка параметров работать, как указано в таблице.
И нажмите запустить, чтобы начать измерение и получить кривую расстояния силы калибровки. Кривая силы получена, как показано на рисунке. На кривой расстояния силы калибровки выберите область для линейного пригонка вытянутой кривой.
Как только линейная подгонка будет на месте, значения будут сохранены программным обеспечением. Затем, как измерения выполняются в среде при температуре 37 градусов по Цельсию, установить температурную переменную в программном обеспечении до 37 градусов, чтобы имитировать физиологические условия как можно ближе. Для выявления разговорных моделей в разделах образца хряща, найти и определить конкретные клеточные модели суставного хряща из остеоартритного колена на фазовом контрастном микроскопе, который может включать в себя отдельные строки, указывающие на здоровые области тканей, двойные струны, указывающие на начало дегенерации тканей, небольшие кластеры, которые являются признаками передовой дегенерации тканей, и большие кластеры, указывающие на разрушение тканей на конечной стадии.
После того, как была определена конкретная желаемая закономерность для перикеллулярных матричных измерений, распоистите кантилевер в непосредственной близости от ячеек и измерьте два участка на выбранный шаблон на один тип матрицы, девять раз на место измерения, включая размер выборки, достаточно большой для учета возможных неточностей. Сосредоточьтесь на клеточной матрице шаблона, которая должна быть измерена и исправить компьютерную мышь в этой точке. Затем сосредоточьтесь на зонде и переместит кончик зонда в точку, ранее зафиксированную компьютерной стрелкой.
Для проведения измерений внеклеточной матрицы выберите область без каких-либо клеток и выполните подход, за которым последует опровержение, так что кантилевер расположен на 100 микрометров над тканью. Затем нажмите запустить, чтобы начать измерения, используя параметр точки набора, полученный путем калибровки кантилевера. Для обработки полученных данных открытое программное обеспечение для обработки данных совместимо с данными, полученными с устройства AFM, и выберите модель Hearst в программном обеспечении для обработки кривых расстояния силы.
Установите коэффициент Пуассона до 0,5, форму наконечника как сферическую, а радиус наконечника до 12,5 микрометров. После того, как все параметры были скорректированы, результаты будут установлены и Модул Янг будет рассчитываться с помощью программного обеспечения. Вдоль физиопатологической модели от струн до двойных струн и от малых до больших кластеров, как внеклеточные, так и перицеллюлярные матричные эластичные модули значительно уменьшаются между каждым изменением шаблона, за исключением между строками и двойными струнами.
Кроме того, существенно не меняется внеклеточно-перицеллюлярное матричное соотношение, в то время как наблюдается заметное снижение абсолютных различий в эластичности между внеклеточными и перицеллюлярными матрицами. Значения эластичности зависят от различных условий, таких как глубина отступа или свойства наконечника кантилевера. Таким образом, AFM лучше всего подходит для сравнения различных условий в рамках одной и той же экспериментальной установки.
Поскольку AFM измеряет локаленную эластичность выборки, секции должны быть установлены для того, чтобы обеспечить точные измерения и избежать повреждения кантилевером. Для дальнейшего анализа процессов, ответственных за изменения эластичности тканей, биохимическая количественная оценка структуры белков, представляющих интерес, может быть выполнена с помощью западных пятен или ELISAs.
