Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti regolano la loro funzione e vitalità. L'AFM consente la quantificazione precoce dell'osteoartrite a livello cellulare sulla base di misurazioni dell'elasticità. AFM consente l'acquisizione di misure a livello cellulare senza danneggiare il campione e con un'alta risoluzione, affidabilità e sensibilità.
I cambiamenti di proprietà biomeccanica si verificano all'inizio dell'osteoartrite. La misurazione dell'elasticità locale della cartilagine articolare consente di trarre valide conclusioni sul grado di degenerazione dei tessuti locali. Per valutare i cambiamenti degenerativi all'interno dell'articolazione del ginocchio umano, utilizzare prima un bisturi per tagliare la cartilagine articolare nel suo complesso dall'osso subcondrale e incorporare il campione di cartilagine nel mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola Cryotome che si congela a bassa temperatura nel dispositivo Cryotome.
Quando il campione si è congelato, utilizzare un criotomo standard per acquisire sezioni di tessuto spesse 35 micrometri dallo strato più alto della cartilagine articolare, raccogliendo ogni sezione su singoli vetrini. Una volta ottenute tutte le sezioni, sciacquare i campioni tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio per rimuovere il mezzo di incorporamento solubile in acqua. Rimuovere la prima diapositiva dal lavaggio.
Successivamente, aggiungere da due a tre gocce di colla per campione biocompatibile per sezione in singole piastre di Petri compatibili con AFM. Rimuovere la soluzione in eccesso dal campione e premere delicatamente i bordi della sezione essiccata sulle macchie di colla. Dopo due minuti, coprire attentamente i tessuti incollati con il mezzo L-15 di Leibovitz senza L-glutammina e posizionare i piatti in un incubatore di coltura cellulare fino a quando i campioni devono essere analizzati.
Per preparare il dispositivo AFM, regolare un blocco di gas per la misurazione in un ambiente liquido sul supporto AFM in modo che la superficie superiore sia parallela al supporto e utilizzare una pinzetta per montare con cura il sbalzo selezionato sulla superficie del blocco di vetro in modo che la punta AFM con la microsfera sporge sul piano ottico lucido. Per stabilizzare la sbalzo sul blocco di vetro, far scorrere la molla metallica nella scanalatura del blocco e utilizzare una pinzetta per bloccare la parte superiore della sbalzo con la molla. Posizionare con cura il blocco di vetro con il sbalzino sulla testa AFM e fissare il blocco con il meccanismo di bloccaggio integrato.
Quindi montare la testa AFM con la sbalziola sul dispositivo AFM con la molla rivolta a sinistra. Per montare il campione sul dispositivo AFM, posizionare la piastra di Petri del campione sul portacampioni AFM e impostare il riscaldatore della piastra di Petri su 37 gradi Celsius. Dopo circa 20 minuti, aprire il software del dispositivo e l'allineamento laser e avvicinarsi alle finestre di impostazione dei parametri.
Successivamente, accendere il motore stepper, la luce laser e la fotocamera CCD e utilizzare la funzione motore stepper per abbassare la sbalziera in passi di 100 micrometri fino a quando il cantilever non è completamente immerso nel mezzo. Utilizzare le viti di regolazione per dirigere il laser sopra il cantilever e utilizzare le viti del dispositivo AFM per regolare il raggio laser in modo che il fascio riflesso cada al centro del fotorivelante. Una volta regolato il cantilever laser, regolare il fotodetector in base alle esigenze per impostare il segnale di somma su un volt o superiore e le deformazioni laterali e verticali a quasi zero.
Per ottenere la curva di forza di calibrazione, eseguire un approccio dello scanner con i parametri di approccio indicati nella tabella. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura tissutale, ritrarre il cantilever di 100 micrometri. Impostare i parametri di esecuzione come indicato nella tabella.
Quindi fare clic su Esegui per avviare una misurazione e ottenere una curva di distanza della forza di calibrazione. La curva di forza è ottenuta come illustrato nella figura. Sulla curva di distanza della forza di calibrazione, selezionate la regione per una vestibilità lineare della curva retrattile.
Una volta che la vestibilità lineare è in atto, i valori verranno salvati dal software. Quindi, poiché le misurazioni vengono eseguite in mezzo a 37 gradi Celsius temperatura, impostare la variabile di temperatura nel software a 37 gradi per imitare le condizioni fisiologiche il più vicino possibile. Per identificare i modelli conversite nelle sezioni del campione di cartilagine, individuare e identificare i modelli cellulari specifici della cartilagine articolare dal ginocchio osteoartritico al microscopio a contrasto di fase, che possono includere singole stringhe indicative di aree tissutali sane, doppie stringhe indicative dell'inizio della degenerazione tissutale, piccoli ammassi, che sono segni di degenerazione avanzata dei tessuti, e grandi cluster, indicativi della distruzione dei tessuti allo stadio finale.
Una volta identificato uno specifico modello desiderato, per le misurazioni della matrice pericellulare, posizionare il cantilever in prossimità delle cellule e misurare due siti per modello scelto per tipo di matrice, nove volte per sito di misurazione, compresa una dimensione del campione abbastanza grande da tenere conto di possibili imprecisioni. Concentrati sulla matrice cellulare del modello da misurare e fissa il mouse del computer in quel punto. Quindi, concentrati sulla sonda e sposta la punta della sonda nel punto precedentemente fissato dalla freccia del computer.
Per eseguire misurazioni della matrice extracellulare, selezionare una regione senza cellule ed eseguire un approccio seguito da una retrazione in modo che il cantilever sia posizionato a 100 micrometri sopra il tessuto. Quindi fare clic su esegui per avviare le misurazioni, utilizzando il parametro setpoint ottenuto dalla calibrazione del cantilever. Per elaborare i dati ottenuti, aprire un software di elaborazione dati compatibile con i dati ottenuti dal dispositivo AFM e selezionare il modello Hearst nel software per l'elaborazione delle curve di distanza di forza.
Impostare il rapporto Poisson su 0,5, la forma della punta come sferica e il raggio della punta a 12,5 micrometri. Una volta che tutti i parametri sono stati regolati, i risultati saranno montati e il modulo di Young sarà calcolato dal software. Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie e dai cluster piccoli a quelli grandi, sia i moduli elastici a matrice extracellulare che pericellulare diminuiscono significativamente tra ogni cambiamento di pattern tranne che tra stringhe e stringhe doppie.
Inoltre, il rapporto matrice extracellulare-pericellulare non cambia in modo significativo, mentre si osserva una marcata diminuzione delle differenze assolute di elasticità tra le matrici extracellulari e pericellulari. I valori di elasticità dipendono da varie condizioni come la profondità di indentazione o le proprietà della punta a sbalzino. AFM è quindi più adatto a confrontare condizioni diverse all'interno della stessa configurazione sperimentale.
Poiché l'AFM misura l'elasticità locale del campione, le sezioni devono essere fissate in posizione per consentire misurazioni precise ed evitare danni a sbalzi. Per analizzare ulteriormente i processi responsabili dei cambiamenti di elasticità tissutale, la quantificazione biochimica della struttura delle proteine di interesse può essere eseguita tramite macchie occidentali o ELISA.
