עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (R00MH103531 ו- R01MH116901 ל- J.A.), מענק הכשרה מוקדמת מהמכון הלאומי לרפואה כללית (T32GM007635 ל- S.R.), ומלגת לידה היל גיליאם למחקר מתקדם (GT11021 ל- S.R.). אנו מודים לד"ר קווין וולפרי על העזרה במיקרוסקופ, ד"ר K אולריך באייר על השימוש במיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי שלו, ותומס סודהוף (אוניברסיטת סטנפורד) על פלסמיד LRRTM2.

1. תרבות תאים ו transfection
<ol><li>הפוך את המדיה הסלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של הנשר בינוני) בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז, L-גלוטמין & נתרן פירובט ו 10% FBS. מסנן סטרילי.</li>
	<li>קבוע מראש ליגנדים מתאימים קולטנים לבדיקת צבירה. הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלה, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדים קולטנים של עניין באו לידי ביטוי cDNAs ב pcDNA3.1. הרכבת גיבסון שימשה להכנסת Neurexin3α לתוך pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: טטאקטטאגקטגטגGGCGCGCGTCCGCCAקטגCTCTCTC / גאגג'גקטגאגאטקטאקאטקטקטקטגTTCCTT.</li>
	<li>הכן תאי HEK293T.<ol>
<li>לגדל תאי HEK293T לעיסוק בבקבוק T-75 אחד.</li>
		<li>לאחר המפגש, להשתמש 2 מ"ל של טריפסין ומניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיה HEK לבקבוק כדי resuspend תאים ולהעביר את כל 8 מ"ל לצינור חרוט 15 מ"ל.</li>
		<li>גלולה ב 500 x g במשך 5 דקות ו resuspend במדיה סלולרית HEK עבור סך של 8 מ"ל.</li>
		<li>לספור תאים ולהוסיף 735,000 תאים לתוך כל באר של צלחת 6-well. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 2 מ"ל עבור כל באר באמצעות מדיית תא HEK.</li>
		<li>מניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול בן לילה או עד שהם מגיעים 50-60% מפגש.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfect HEK293T תאים באמצעות שיטת סידן פוספט13.<ol>
<li>להחליק היטב 1 עם 3 מיקרוגרם של החלבון של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- ו 1 מיקרוגרם של mCherry).</li>
		<li>תעביר היטב 2 כמו בשלב 1.4.1. אבל עם חלבון מוטציה של עניין (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>חוצה היטב-3 עם 3 מיקרוגרם של ligand של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי אחר (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1 LRRTM2 ו 1 מיקרוגרם של GFP).</li>
		<li>להחדיר גם-4 ו- well-5 לשמש פקדים שליליים: גם 4 עם 1 מיקרוגרם של GFP ו well-5 עם 1 מיקרוגרם של mCherry.</li>
		<li>הכן צלחת נוספת (כמו בשלב 1.4.1-1.4.4) אם נדרשים תנאים או פקדים נוספים (Neurexin3αWT/A687T SS4+). הערה: יעילות Transfection מנותחת 24 שעות לאחר transfection תחת מיקרוסקופ epifluorescence ו כימות כמו מספר התאים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי הם היו transfected עם. גישה יעילה יותר תכלול את ההשתנות של תאי HEK עם קידוד וקטורי דו-יסטרי לחלבון פלואורסצנטי ואת הליגנד של עניין ומומלץ מאוד מעל שינוי-תיקון. במקרה של מחקר זה, אלפא Neurexins הם ~ 4.3 kb ועוצמת פלואורסצנטיות נמוכה נצפתה באמצעות מערכת bicistronic המחייבת שיתוף transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>48 שעות לאחר טרנס-פליטה, תאי קציר לצבירה.<ol>
<li>לשטוף כל באר פעמיים עם PBS.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של EDTA 10 מ"מ ב PBS לתוך כל באר בעדינות לנתק אינטראקציות תא לתא צלחת דגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות. הערה: טריפסין אינו מומלץ לשלב 1.5.2 עקב מחשוף פרוטאוליטי פוטנציאלי של מולקולות הידבקות במחקר. בנוסף, לאחר הוספת EDTA ייתכן שהפרוטוקול לא יופסק עד להשלמתו מכיוון שהתאים ייחשפו כעת לתנאי הסביבה.</li>
		<li>הקישו בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, וקצרו כל באר לצינורות חרוטים נפרדים של 15 מ"ל.</li>
		<li>צינורות חרוט צנטריפוגה ב 500 x גרם וטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>בעוד תאים הם pelleting, להכין 6 צינורות דגירה על ידי תיוג החלק העליון של כל צינור microcentrifuge עם כל מצב. הערה: יש להשתמש בכל תמורות של תנאי GFP ו- mCherry כדי להקיף את כל התנאים הניסיוניים והבקרות המתאימות. לדוגמה: 1. GFP/mצ'רי, 2.mצ'רי/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-–mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- – mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-- mCherry/LRRTM2 – GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- – mשרי / LRRTM2 - GFP. הפוך צינורות נוספים כדי להתאים תנאים נוספים ובקרות.</li>
	<li>הסר את התאים supernatant ו resuspend ב 500 μL של מדיה HEK עם 10 mM CaCl2 ו 10 mM MgCl2 מחומם ל 37 °C (69 °F). הערה: התוספת של CaCl2 ו- MgCl2 מאפשרת למולקולות הידבקות להקים מחדש את הכריכה ונדרשת רק אם שותפי האינטראקציה הטרנס-תאית המדוברים דורשים ציות דו-תאי להדבקה.</li>
	<li>לספור את התאים בכל צינור חרוט 15 מ"ל באמצעות hemocytometer ו aliquot 200,000 תאים של כל תנאי לתוך הצינור המתאים משלב 1.6.1 עבור 1:1 לערבב בנפח כולל של 500 μL. הערה: זה צריך לקחת רק 5 דקות לכל תנאי לספור כמויות aliquot.</li>
	<li>דגירה צינורות בטמפרטורת החדר במסובב צינור איטי.</li>
</ol>2. רכישת תמונה
<ol><li>מטב פרמטרי רכישת מיקרוסקופ עבור דגימות ספציפיות. בדוגמה זו, תמונות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה. השתמש במטרת אוויר 5x (NA: 0.15; WD: 20000 מיקרומטר) כדי לקבל שדה גדול מספיק לניתוח.</li>
	<li>להעריך צבירה בסיסית מיד לאחר ערבוב שני התנאים של תאי HEK בשלב 1.8. אלה עכשיו תמונות 'זמן אפס'.<ol>
<li>פיפטה 40 μL של כל תערובת מדגם על שקופית מיקרוסקופ טעונה ותמונה תחת פלואורסצנטיות בשני ערוצי 488 ו 561.</li>
		<li>רכוש שלושה שדות תצוגה שונים במישור מיקוד אחד לכל טיפה לדוגמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רכוש תמונות סופיות ב- 60 דקות כתמונה 'זמן 60'.<ol>
<li>כדי לקבל את התמונה 'זמן 60' של התערובת לאחר דגירה של 60 דקות, לקחת עוד 40 μL מדגם של כל תנאי מצינורות מסתובבים פיפטה כל מדגם על שקופית טעונה. תמונה כמו בשלב 2.2.2. הערה: יש לבדוק צבירת תאים כל 15 דקות עד שתתרחש רוויה. תזמון הצבירה יהיה תלוי בחלבונים הנבדקים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח ImageJ/פיג'י
<ol><li>כדי לכמת את היקף הצבירה באמצעות פיג'י/ImageJ, שמור קבצי ניתוח.<ol>
<li>שמור את קבצי הקידוד המשלימים שסופקו בתיקיה פקודות מאקרו של imageJ במחשב.</li>
		<li>התקן את מאקרו הצבירה שסופק (תוספים, פקודות מאקרו, התקן ובחר בקובץ "צבירהאי.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>קבע ערכי סף.<ol>
<li>טען קובץ .tif 'זמן אפס' לתוך imageJ ופצל את הערוצים (תמונה | | צבע פיצול ערוצים). הערה: התמונה 'זמן אפס' משמשת לקביעת גודל הסף והפונקטה הקטן ביותר עבור הניסוי כולו.</li>
		<li>מסיכה כל ערוץ (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_MakeMask). החלון 'הפוך מסיכה מתמונה' יופיע. בתיבות הסימון לצד קבע סף לתמונה וקבע פארמים של אשכול מהיסטוגרמה ולחץ על אישור.</li>
		<li>קבע את סף התמונה באמצעות סרגל השקופיות, הקלט את המספר משמאל לסרגל השקופיות ולחץ על אישור.</li>
		<li>תופיע היסטוגרמה של גודל אשכול. בחר גודל אשכול מההיסטוגרמה המתאימה לניסוי, הקלד מספר זה בתיבה גודל אשכול מינימלי: ולחץ על אישור. אשכולות מתחת לגודל זה לא ינותח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תריץ את הניתוח.<ol>
<li>פתח את התמונה 'זמן 60' של תנאי 1 ב imageJ ולפצל את הערוצים כמו בשלב 3.2.1.</li>
		<li>מסיכה כל ערוץ (תוספים, פקודות מאקרו AggregationAssay_MakeMask). השתמש באותו סף ובאותו גודל שנקבעו בשלב 3.2.3 ובשלב 3.2.4. בטלו את הבחירה בתיבות שליד 'קביעת סף לתמונה' ו'קביעת תערוכי אשכול מהיסטוגרמה' והקלדו ידנית את הגודל והסף בשדות המתאימים ולחצו על הלחצן 'אשר'.</li>
		<li>חישוב אינדקס הצבירה (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_CalculateOverlap). בחר את הערוצים עם המסיכה שיש להשוות ואת הספריה שבה ישמרו הקבצים המתקבלים.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.3.1-3.3.3 עבור כל תמונה 'זמן 60' בכל תנאי. הערה: אינדקס הצבירה מוגדר כאזור החפיפה הכולל חלקי הסכום של שני אזורי הערוצים פחות אזור החפיפה כפול 100 (אינדקס צבירה = אזור חפיפה/[אזור של ערוץ 1 + אזור של ערוץ 2 – אזור חפיפה] x 100). נורמליזציה זו היא פעולת 'OR' בין שני הערוצים עם המסיכה המייצגת את סך כל הפיקסלים בכל אחת מהמסכות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון המתרחשות טרנס במהלך הידבקות בתא יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים תאיים בסיסיים כולל היווצרות, פונקציה ותחזוקה של סינפסות במהלך התבגרות ושיפוץ. ההשלכות של אינטראקציות בין תא לתא מתרחבות מעבר לנוירוביולוגיה ויש להן תפקידי?...

אינטראקציות סינפטיות בהנחיית מולקולות הידבקות סינפטית הן הבסיס לפיתוח, ארגון, מפרט, תחזוקה ותפקוד של סינפסות ויצירת רשתות עצביות. הזיהוי של מולקולות הידבקות תאים טרנס-סינפטיות אלה גדל במהירות; לכן, חשוב ביסודו לזהות שותפים מחייבים ולהבין כיצד מולקולות הדבקה חדשות אלה אינטראקציה אחד עם השני. בנוסף, רצף הגנום זיהה מוטציות ברבים ממולקולות הידבקות אלה הקשורות בדרך כלל לשלל הפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירופסיכיאטריות והתמכרות1. מוטציות בגנים המקודדות למולקולות סינפטיות של הידבקות בתאים עלולות לשנות לרעה אינטראקציות טרנסג'נדריות ועשויות לתרום לשינויים פתופיזיולוגיים בהיווצרות סינפסה או תחזוקה.
מבחנים מרובים קיימים כדי להעריך כמותית אינטראקציות חלבון חלבון כגון קלורימטריה איזותרמית, dichroism מעגלי, תהודה פלסמון פני השטח2 ולמרות כמותי בטבע, יש להם מספר מגבלות. ראשית, הם דורשים חלבון רקומביננטי, לפעמים דורשים צעדי טיהור ארוכים ומייגעים. שנית, הם דורשים ציוד מיוחד מתוחכם ומומחיות טכנית. שלישית, הם יכולים להפרז בהיקף הכריכה כפי שהם מאפשרים הן אינטראקציות cis ו טרנס בין חלבונים הקשורים באופן טבעי קרום vivo. כאן אנו מציעים בדיקה פשוטה ומהירה יחסית הבדוקה באופן בלעדי אינטראקציות טרנסג'נדריות.
כדי לעקוף רבים מהסיבוכים הקשורים למטעני חלבון מטוהרים, יש לנו אופטימיזציה של בדיקת אינטראקציה חלבון מבוסס תאים כי recapitulates אינטראקציות טרנס במערכת תאים הטרולוגית מופחתת. מבחנים אלה שימשו בעבר בצורות שונות לחקר אינטראקציות טרנס-תאיות. בגישה זו, מולקולות הידבקות תאים מועמדים הם transfected לתוך תאי HEK293T. בתנאים פיזיולוגיים, תאי HEK293T אינם מפגינים צבירה עצמית, מה שהופך אותם למודלים למופת לבדיקה זו. עם זאת, כאשר אוכלוסיות בודדות של תאי HEK המביעים קולטן ו ligand משולבים, הכריכה של הקולטן ואת ligand כוחות צבירה של תאי HEK להתרחש. צבירה זו מתווכת אך ורק על ידי אינטראקציות טרנסג'נדריות ובדרך כלל ניתן לצפות בה בעשרות דקות. בשיטה זו אין צורך בצעדי טיהור חלבונים, ויעילות השיטה מסתמכת על הפרדיגמה לפיה משולבות אוכלוסיות של תאי HEK המבטאות מולקולות הידבקות קוגניציה ולאחר מכן מצולמות רק עשרות דקות לאחר מכן. בנוסף, שיטה זו זולה יחסית, שכן לא נדרשים נוגדנים ולא ציוד יקר. הציוד היחיד הנדרש לרכישת נתונים הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. יתרון נוסף למבחן מבוסס תא זה הוא היכולת לסנן במהירות את ההשפעה של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלות על אינטראקציות טרנסג'נדריות. זה יכול להתבצע על ידי transfecting תאי HEK עם cDNAs של גרסאות מוטציה של החלבון של עניין.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים דוגמה שבה אנו חוקרים אם מוטציה שגויה Neurexin3α (Neurexin3αA687T), זוהה בחולה שאובחן עם מוגבלות אינטלקטואלית עמוקה ואפילפסיה, משנה אינטראקציות טרנס עם חלבון טרנסממברן חוזר עשיר לאוצין 2 (LRRTM2). Neurexin3α הוא חבר במשפחה השמורה מבחינה אבולוציונית של מולקולות הידבקות תאים presynaptic ובעוד העבודה האחרונה זיהתה תפקידים מרובים בסינפסה3,4,5,6,7, ההבנה הסינפטית שלנו של מולקולה זו וכל בני משפחת neurexin נשאר שלם. LRRTM2 הוא חלבון הידבקות תאים פוסט-סינפטי מעורר המשתתף בהיווצרות סינפסה ותחזוקה8,9,10. חשוב לציין, LRRTM2 באופן בלעדי אינטראקציה עם isoforms neurexin שחסרים באתר splice 4 אקסון חלופי (SS4-) אבל לא עם isoforms neurexin המכיל את אתר splice 4 exon חלופי (SS4+). מוטציית ההחמצה האנושית (A687T) שזוהתה ב Neurexin3α ממוקמת באזור חוץ-תאי לא מתורבת השמור מבחינה אבולוציונית ושמור בין כל אלפא neurexins7. כמו האינטראקציהביןשתי מולקולות אלה הוקמה 8,9,11, אנו מציגים את השאלה: האם היכולת מחייבת של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2 השתנה על ידי מוטציה נקודת A687T? בדיקה זו גילתה כי מוטציית נקודת A687T שיפרה באופן בלתי צפוי את הצבירה של Neurexin3α ל- LRRTM2 מה שמרמז על כך שהאזור החוץ-תאי שבו נמצאת המוטציה הנקודתית, ממלא תפקיד בתיווך אינטראקציות טרנסינפטיות.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&amp;mdash;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilization of HEK media</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td><td>Ward&amp;rsquo;s Science</td><td>470224-998</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>6 well sterile tissue culture plates</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Centrifuge- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>CO2 cell incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubation of HEK cells during growth</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passaging/harvesting HEK cell</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>Falcon Vented culture flasks, 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; growth area</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Model system</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Image analysis</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Calcium phosphate transfection</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passaging HEK cells</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td></td><td></td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Image acquisition</td></tr><tr><td>Wide-field microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Image acquisition</td></tr></tbody></table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

אינטראקציות חלבון בממשקים סלולריים מכתיבות שפע של תוצאות ביולוגיות החל מהתפתחות רקמות והתקדמות סרטן ועד היווצרות ותחזוקה של סינפסה. רבות מהאינטראקציות הבסיסיות הללו מתרחשות בטרנס ובדרך כלל נגרמות על ידי אינטראקציות הטרופיליות או הומופיליות בין תאים המבטאים זוגות כריכה מעוגנים בקרום. המבהיר כיצד מוטציות רלוונטיות למחלות משבשות את אינטראקציות החלבון הבסיסיות האלה יכול לספק תובנה על מספר עצום של תחומי ביולוגיה של התא. מבחני אינטראקציה רבים של חלבון-חלבון אינם מנטרלים בדרך כלל בין אינטראקציות cis ו- trans, מה שעלול להוביל להערכת יתר של היקף הכריכה המתרחשת ב- vivo וכרוכה בטיהור אינטנסיבי של חלבון ו/או ציוד ניטור מיוחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט אופטימיזציה המאפשר תצפית וכימות של אינטראקציות טרנס בלבד ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. מבחני צבירת תאי HEK כרוכים בערבוב של שתי אוכלוסיות עצמאיות של תאי HEK, שכל אחת מהן מבטאת ליגנדים קוגניאטים הקשורים לקרום. לאחר תקופת דגירה קצרה, הדגימות מסומנות והצטברויות המתקבלות מכמתות.

מוטציית A687T מגבירה את Neurexin3α SS4- מחייב LRRTM27 כדי לחקור כיצד אינטראקציות בין-תאיות של שני חלבונים סינפטיים ידועים מושפעות מהכנסת מוטציה נקודתית שנמצאה בחולה עם מוגבלות אינטלקטואלית ואפילפסיה, השתמשנו במדיין צבירת התאים הנ"ל HEK (איור 1). התאים הודבקו לפי סעיף 1 ו...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.4K Views.  University of Colorado Denver School of Medicine. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Video: Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Biochemistry

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Bioengineering

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

כימות מבוסס הדמיה של תאים חיים על מולקולות בודדות של אינטראקציות חלבונים

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

מחבר זרקור: הערכה של דינמיקה של עיבוי חלבונים בתאים אנושיים חיים

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

גישות גנטיות ביוכימיים עבור

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים