שיטה זו יכולה לאשר את היכולת להרכיב organoid של אפיתל villi דה-הבחנה לרכוש סמני תאי גזע ב vivo. האוסף של villi מבוצע באמצעות גירוד ולא שיטת EDTA chelation המונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה במידת הצורך עבור חניכה organoid. שיטה זו ישימה ברקמות אפיתל שבהן תאים מתרבים ומובחנים מוגדרים פיזית והתאים המבדילים מבטאים סמני תאי גזע ב- vivo.
כמה גורמים בפרוטוקול זה צריכים להיקבע אמפירית, כולל השלב האופטימלי לקציר את villi ואת הלחץ האופטימלי עבור גירוד villi, אשר ייקח זמן ותרגול. לגרום לנוק-אאוט של Smad4 ולבטא-קטנין להשיג מוטציה בתפקוד בעכברים מוטנטיים עם הזרקה תוך-אינטריטונלית של טמוקסיפן ושמן תירס במשך ארבעה ימים רצופים. לאחר המתת חסד של העכבר, לרסס את הבטן עם 70%אתנול כדי למנוע פרוות העכבר מלהיכנס לחלל הצפק.
פתח את חלל הבטן עם מספריים דיסקציה כדי לחשוף את המעי ולבודד את המעי באמצעות מספריים ומלקחיים. לנתח את החצי הפרוקסימלי של התריסריון, ולאחר מכן לשטוף את התריסריון עם חמישה מיליליטר של PBS קר קרח במזרק 10 מיליליטר כדי לנקות את התוכן הזוהר. פתחו את התריסריון לאורך עם מספריים זוויתיים והניחו את התריסריון שטוח על צלחת פטרי באורך 15 ס"מ על קרח עם לומן של התריסריון מול המפעיל.
לפני תחילת השריטות, מניחים מסננת רשת 70 מיקרומטר באחת הבארות של צלחת תרבית רקמות של שש בארות. מלאו את כל הבארות בארבעה מיליליטר של PBS 1X ומניחים את הצלחת על קרח. לגרד את villi באמצעות שתי שקופיות זכוכית מיקרוסקופית, אחד להחזיק את התריסריון למטה והשני לגרד.
לגרד את הצד הזוהר של התריסריון באופן שטחי פעמיים כדי להסיר את הריר מבלי להסיר את villi, ולאחר מכן לגרד את התריסריון פעמיים נוספות כדי לאסוף את villi על השקופיות מבלי לקשור את הקריפטות. השתמש פיפטה העברה מיליליטר אחד המכיל PBS להעביר את villi למסננת רשת 70 מיקרומטר בצלחת שש טוב. לאסוף את villi אחרי כל שריטה.
כדי להסיר קריפטות רופפות, לשטוף את villi שנאסף עם מסננת 70 מיקרומטר על ידי העברת המסננת דרך סדרה של בארות בצלחת שש באר המכיל ארבעה מיליליטר של PBS קר קרח לכל טוב. באמצעות פיפטה P1000, להעביר את השעיית villi בכשלושה מיליליטר של PBS מ מסננת 70 מיקרומטר לצינור חדש 15 מיליליטר על קרח. השתמש 0.1% BSA מצופה קצות פיפטה P200 קצה להעביר נפח 50 microliter של מתלה villi על שקופית זכוכית.
לספור את מספר villi בטיפת 50 microliter תחת הגדלה 4X כדי לקבוע את הריכוז של villi בהשעיית PBS ולאשר את היעדר קריפטות קשורות. כדי צלחת villi, להשתמש 0.1% מצופה BSA P200 קצות פיפטה קהה קצה להעביר את villi לצינור microcentrifuge עבור צפיפות ציפוי של שישה villi לבאר ב 12.5 microliters של מטריצת BME-R1. סובבו את הוילי במשך שתי דקות ב-200 פעמים ג'י ב-4 מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant ולחזור על centrifugation כדי להסיר כל PBS שיורית. במכסה המנוע של זרימה למינארית, יש להפיץ מחדש את גלולה הווילי בעדינות בכמות הנדרשת של BME-R1 קר המופשר על קרח. באמצעות פיפטת P20, צלחת 12.5 מיקרוליטרים של villi במטריצה BME-R1 לכל באר של צלחת 96 טוב U-תחתון התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
לדגור את הלוח באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר התגבשות של מטריצת BME-R1. לכל באר, הוסף 125 מיקרוליטרים של מדיית ENR מחוממת מראש בתוספת כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור את villi מצופה באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולשנות את התקשורת כל יומיים.
להשליך כל באר שבה organoids מופיעים לפני יומיים. יש הבדל במראה האורגנוידים שיוצאים מהקריפטות לעומת האפיתל של וילי המובחנ מאותו מעי עכבר. האורגנוידים שמקורם בקריפטה מופיעים בן לילה כמבנים כדוריים עם גבולות מוגדרים היטב.
הקינטיקה והמראה המורפולוגי של האורגנוידים שיזם מווילי נבדקו, שנראים מעוצבים באופן לא סדיר בהתחלה ולוקח יומיים עד חמישה ימים לפני שניתן לראות אותם תחת מיקרוסקופ. חניכה אורגנויד משני וילילי שונים מוצגת. villi עם פוטנציאל יצירת אורגנויד נראה צפוף, אולי בשל השמירה של mesenchyme הבסיסי.
חניכת האורגנויד מהווילות ניכרת ביום השני מאחד הווילי. בעוד בווילות האחרות, האורגנויד מופיע ביום הרביעי. זה חיוני כדי לנקוט את הצעדים הנכונים כדי למנוע זיהום קריפטה בעת קצירת villi וגידול organoids וכתוצאה מכך.
הבדלים פנוטיפיים בין האורגנוידים העולים מהקריפטות לבין villi של אותה מוטציה נצפו בעקבות הליך זה, כך שניתן היה לבצע ניסויים נוספים כדי לחפש הבדלים מולקולריים בין השניים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההבדלים בין organoids הנובע קריפטות אנדוגני לעומת קריפטות חוץ רחמיות הנובעות דה-בידול, ולכן ניתן לטפל בהשלכות של דה-בידול.
