פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת של פעילות מערכת האיתות המערכתית של הצמח באמצעות ניטור הדינמיקה של הסידן והגלוטמט האפופלסטי בתגובה לפציעה. שיטת הדמיה זו בזמן אמת מספקת כלי חזק להבנת הדינמיקה של האותות המהירים והינעירוניים בצמחים, המשלבים רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה וקלות שימוש. פרוטוקול זה מציע את הפוטנציאל לספק תובנה חדשה על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של המערכת סידן איתות הן תגובות מתח ביוטי ו abiotic במינים אחרים של צמחים.
הדגמת ההליך תהיה טאקויה אומורה, פוסט דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפעלת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי ממונע, מצויד בעדשה אובייקטיבית פי 1 ומצלמת sCMOS. קבע את תצורת הגדרות ההתקן כך שיוקרנו עם אור עירור שבמרכזו 470 ננומטר, שנבחר באמצעות מסנן המשדר אור בין 450 ל- 490 ננומטר.
להשיג אור פליטה באמצעות מסנן המשדר בין 510 ל 560 ננומטר. מוציאים את המכסה מהתבשיל המכיל את הצמח ומניחים אותו מתחת לעדשה האובייקטיבית. בדוק את אות הפלואורסצנט מהצמח.
לאחר מכן המתינו כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנט באמצעות תוכנת ההדמיה של המיקרוסקופים.
הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות. תמונה במשך חמש דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט. כדי לקבוע את רשומת הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת לפחות 10 מסגרות לפני יישום פציעה או גלוטמט.
להדמיה בזמן אמת של יון סידן ציטוזולי המושרה על ידי פצע ושינויי ריכוז גלוטמט אפופלסטיים, חותכים את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 עם מספריים. להדמיה בזמן אמת של גלוטמט עוררה שינויים בסידן ציטוזולי, חותכים כמילימטר אחד מקצה העלה L1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר 20 דקות לפחות יש למרוח 10 מיקרוליטרים של 100 גלוטמט מילימולארי על פני השטח החתוכים של העלה.
לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדר אזור מעניין במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות. הגדר שני ROIs לחישוב המהירות של גל הסידן. בתוכנת ההדמיה לחץ על מדידת זמן, הגדרה ועיגול.
למדוד את המרחק בין שני האזורים על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה, אורך וקו פשוט. למדוד את ערכי פלורסנט גלם בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על ידי לחיצה על מידה, ולאחר מכן לייצא את הנתונים הגולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני, כדי להמיר את האות פלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן. קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסית, הנוי אלוהי כ- F אפס, על-ידי חישוב ה- F הממוצע ב- 10 המסגרות הראשונות בנתונים המוקלטים ולאחר מכן נרמל את נתוני F כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לניתוח גל מהירות הסידן, הגדירו נקודת עלייה משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצגים זיהוי של עלייה בסידן בכל החזר השקעה. לחשב את הפרש הזמן בהגדלת הסידן בין שני ROIs ואת המרחק ביניהם כדי לקבוע את המהירות של כל גל סידן. התפשטות של שינוי מופעל פצע בריכוזים של יון סידן ציטוזולי גלוטמט אפופלסטי מוצג כאן.
חיתוך פטיולה של עלה בצמחים המבטאים GCaMP-3 הוביל לעלייה משמעותית בסידן. זה היה המושרה באופן מקומי ולאחר מכן התפשט ברחבי כלי הדם. האות הופץ במהירות לעלים שכנים תוך דקות ספורות.
עם חיתוך עלה וצמחים המבטאים צ'יטינז בסיסי אני מדביק רחרחן, עלייה מהירה גלוטמט אפופלסטי נצפתה סביב האזור לחתוך. בתוך כמה דקות, האות גם הופץ דרך כלי הדם. להדמיה בזמן אמת של התפשטות אות סידן המופעלת על ידי יישום של גלוטמט, קצה של עלה בצמחים המבטאים CCaMP-3 נחתך.
זה גרם לעלייה מקומית בריכוז יון הסידן הציטוזולי, אבל האות נעלם תוך מספר דקות. לאחר כ -10 דקות, גלוטמט הוחל על פני השטח החתוכים, מה שגרם לעלייה מקומית מהירה בריכוז הסידן הציטוזולי ולאחר מכן להפצת אות זה לעלים דיסטליים. כדי למדוד את השינויים בתוך ריכוז סידן מוצק המושרה על ידי פציעה בעלה המערכתי, שינוי מסלול הזמן של עוצמת האות GCaMP-3 נמדד בשני אזורי עניין.
כמו כן נמדדו שינויים בריכוז הגלוטמט האפופלסטי בתגובה לנזק מכני. חתימת הגלוטמט הגיעה לשיא אחד כ-100 שניות לאחר הפציעה. ניסוי זה צריך להתבצע בתנאים מבוקרים טמפרטורה ולחות כי הם גבוהים על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה.
פרוטוקול זה מציע פוטנציאל לספק תובנות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס איתות למרחקים ארוכים באמצעות מוטנטים כי האלמנטים הפגומים והפוטטיביים של מערכת האיתות במעבדה.
