이 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 칼슘과 아포가소성 글루타민의 역학을 모니터링하여 식물 조직 신호 시스템의 활성을 식물 전체에 실시간으로 이미징 할 수 있습니다. 이 식물 전체 실시간 이미징 방법은 높은 공간 적시적 해상도와 사용 편의성을 결합하여 식물의 신속하고 장거리 신호의 역학을 이해하는 견고한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 식물 종의 생물학적 스트레스 반응과 생물학적 스트레스 반응 모두에서 칼슘 신호 시스템의 공간 및 측두적인 특성에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료 인 우에무라 타쿠야 (Takuya Uemura)가 될 것입니다. 1X 객관적렌즈와 sCMOS 카메라가 장착된 전동 형광 스테레오 현미경을 켜는 것으로 시작합니다. 470 나노미터를 중심으로 한 발광을 중심으로 장치 설정을 구성하고, 450~490나노미터 사이의 빛을 전송하는 필터를 사용하여 선택한다.
510~560나노미터 사이를 전송하는 필터를 사용하여 방출 광을 획득한다. 식물이 들어 있는 접시에서 뚜껑을 분리하여 객관적인 렌즈 아래에 놓습니다. 식물의 형광 신호를 확인합니다.
그런 다음 식물이 새로운 환경 조건에 적응 할 때까지 어둠 속에서 약 30 분 동안 기다립니다. 초점과 배율을 조정하여 시야에서 전체 식물을 볼 수 있습니다. 그런 다음 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 신호를 감지하기 위해 획득 매개 변수를 설정합니다.
녹화 시간을 11분으로 설정합니다. 현미경으로부터 청색광 조사에 식물을 적응시키기 위해 실험을 시작하기 전에 5 분 동안 의 이미지는 녹음을 시작합니다. 평균 기준선 형광 기록을 결정하려면 상처 또는 글루타민트 적용 전에 적어도 10 프레임.
상처 유도 된 세포칼슘 이온과 아포가소성 글루타민제 농도 의 실시간 이미징을 위해, 가위로 잎 L1의 쁘띠올 또는 중간 영역을 잘라. 글루타민산염의 실시간 이미징을 위해 세포성 칼슘 변화를 유발하여, 가위로 주요 정맥을 가로질러 잎 L1 끝에서 약 1mm를 자른다. 적어도 20 분 후 잎의 절단 표면에 100 밀리머 글루타민트의 10 마이크로 리터를 적용합니다.
시간이 지남에 따라 형광 강도 분석을 위해 형광 강도를 분석해야 하는 장소에서 관심 영역을 정의합니다. 칼슘 파의 속도 계산을 위해 두 개의 ROI를 정의합니다. 이미징 소프트웨어에서 시간 측정을 클릭하고 정의하고 동그라미를 친다.
주석과 측정, 길이 및 간단한 선을 클릭하여 두 영역 사이의 거리를 측정합니다. 측정값을 클릭하여 시간이 지남에 따라 각 ROI의 원시 플로레스크 값을 측정한 다음 원시 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내 각 시점에서 형광 신호를 숫자로 변환합니다. 기록된 데이터의 처음 10프레임에 걸쳐 평균 F를 계산한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 F 데이터를 정규화하여 F 제로로 신성한 기준형 형광 값을 결정합니다.
칼슘 속도 파 해석의 경우, 각 ROI의 칼슘 증가를 나타내는 것으로 사전 자극된 값 보다 중요한 신호 상승 점을 정의합니다. 칼슘 의 속도 는 두 ROI와 그 사이의 거리 사이의 칼슘 증가의 시차를 계산합니다. 세포칼슘 이온과 아포가소성 글루타민산염의 농도에 상처 유발 변화의 전파가 여기에 나타난다.
GCaMP-3을 표현하는 식물에서 잎의 잎을 절단하는 것은 칼슘의 상당한 증가로 이어졌다. 그것은 로컬로 유도된 다음 혈관 전체에 퍼졌다. 신호는 몇 분 안에 이웃 잎에 빠르게 전파되었습니다.
나뭇잎과 식물을 자르면서 기본 치티나아제 나는 접착제 스니퍼를 붙이고, 절단 부위 주변에서 급속한 아포가소성 글루타민트 증가가 관찰되었다. 몇 분 안에, 신호는 또한 혈관을 통해 전파. 글루타민트 의 적용에 의해 유발된 칼슘 신호 전파의 실시간 이미징을 위해 CCaMP-3을 표현하는 식물의 잎 가장자리가 절단되었습니다.
이로 인해 국소 세포종 칼슘 이온 농도가 증가했지만 신호는 몇 분 안에 사라졌습니다. 약 10분 후, 글루타민을 절단 표면에 적용하여 세포칼슘농도가 급격히 증가하고 이 신호가 탈엽잎으로 전파되었다. 전신 잎에 상처를 입음하여 유도된 고체 칼슘 농도 내부의 변화를 측정하기 위해 GCaMP-3 신호 강도의 시간 과정 변화를 관심 의 두 영역에서 측정했다.
기계적 손상에 대한 반응으로 아포가소성 글루타민트 농도 변화도 측정되었다. 글루타민트 시그니처는 상처 후 약 100초 만에 한 번의 피크를 보였습니다. 이 실험은 이 환경 조건의 변화에 의해 상승되기 때문에 온도 및 습도 통제 조건하에서 수행되어야 합니다.
이 프로토콜은 실험실 신호 시스템의 결함이 있고 putative 요소가 돌연변이를 사용하여 장거리 신호의 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 제공합니다.
