Este protocolo permite imagens em tempo real da atividade do sistema de sinalização sistêmica da planta através do monitoramento da dinâmica do cálcio e glutamato apoplástico em resposta ao ferimento. Este método de imagem em tempo real de toda a planta fornece uma ferramenta robusta para entender a dinâmica dos sinais de rápida e longa distância nas plantas, combinando uma alta resolução temporal espacial e facilidade de uso. Este protocolo oferece o potencial de fornecer uma nova visão das características espaciais e temporais do sistema de sinalização de cálcio em respostas ao estresse biótico e abiótico em outras espécies de plantas.
Demonstrando o procedimento será Takuya Uemura, bolsista de pós-doutorado do meu laboratório. Comece ligando o microscópio estéreo fluorescente motorizado, equipado com uma lente objetiva 1X e uma câmera sCMOS. Configure as configurações do dispositivo para irradiar com luz de excitação centrada em 470 nanômetros, selecionadas usando um filtro que transmite luz entre 450 e 490 nanômetros.
Adquira luz de emissão usando um filtro que transmite entre 510 e 560 nanômetros. Retire a tampa do prato que contém a planta e coloque-a sob a lente objetiva. Verifique o sinal fluorescente da planta.
Em seguida, aguarde aproximadamente 30 minutos no escuro até que as plantas sejam adaptadas às novas condições ambientais. Ajuste o foco e a ampliação para ver toda a planta no campo de visão. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição para detectar os sinais fluorescentes usando o software de imagem dos microscópios.
Defina o tempo de gravação para 11 minutos. Imagem por cinco minutos antes de iniciar o experimento para aclimatar a planta à irradiação de luz azul a partir do microscópio, em seguida, começar a gravar. Para determinar a fluorescência média da linha de base, regisso pelo menos 10 quadros antes da aplicação do ferimento ou glutamato.
Para imagens em tempo real de íon citosolico de cálcio induzido pela ferida e alterações na concentração de glutamato apoplástico, corte a petiola ou a região média da folha L1 com uma tesoura. Para a imagem em tempo real de glutamato desencadeou alterações citosóicas de cálcio, corte aproximadamente um milímetro da ponta da folha L1 através da veia principal com a tesoura. Após pelo menos 20 minutos aplique 10 microlitadores de 100 mililitros de glutamato na superfície cortada da folha.
Para análise de intensidade de fluorescência ao longo do tempo, defina uma região de interesse no local onde a intensidade da fluorescência deve ser analisada. Defina dois ROIs para o cálculo de velocidade da onda de cálcio. No software de imagem clique na medição de tempo, defina e circule.
Meça a distância entre as duas regiões clicando em anotações e medição, comprimento e linha simples. Meça os valores de floresnce brutos em cada ROI ao longo do tempo clicando na medida e, em seguida, exporte os dados brutos para o software de planilha, para converter o sinal fluorescente em números em cada ponto de tempo. Determinar o valor da fluorescência da linha de base, que é adivinhado como F zero, calculando a média F sobre os primeiros 10 quadros nos dados registrados, e então normalizar os dados F conforme descrito no manuscrito do texto.
Para a análise da onda de velocidade de cálcio, defina um ponto de elevação significativo do sinal acima dos valores pré-estimulados como representando a detecção de um aumento de cálcio em cada ROI. Calcule a diferença de tempo no aumento do cálcio entre os dois ROIs e a distância entre eles para determinar as velocidades de qualquer onda de cálcio. A propagação de uma mudança desencadeada pela ferida nas concentrações do íon citosolico de cálcio e glutamato apoplástico é mostrada aqui.
Cortar a petiole de uma folha em plantas expressando GCaMP-3 levou a um aumento significativo no cálcio. Foi induzido localmente e depois se espalhou por toda a vasculatura. O sinal foi rapidamente propagado para folhas vizinhas em poucos minutos.
Ao cortar uma folha e plantas expressando chitinase básica eu cola sniffer, observou-se um rápido aumento de glutamato apoplásico ao redor da região de corte. Em poucos minutos, o sinal também se propagou através da vasculatura. Para a imagem em tempo real da propagação do sinal de cálcio desencadeada pela aplicação do glutamato, a borda de uma folha em plantas expressando CCaMP-3 foi cortada.
Isso causou um aumento da concentração de íons de cálcio citosocos locais, mas o sinal desapareceu em poucos minutos. Após aproximadamente 10 minutos, o glutamato foi aplicado na superfície cortada, causando um rápido aumento local na concentração de cálcio citosolico e, em seguida, propagação deste sinal para folhas distais. Para medir as mudanças dentro de uma concentração de cálcio sólida induzida pelo ferimento na folha sistêmica, a mudança de curso de tempo da intensidade do sinal GCaMP-3 foi medida em duas regiões de interesse.
Também foram medidas as mudanças de concentração de glutamato apoplástico em resposta a danos mecânicos. A assinatura do glutamato exibiu um único pico em aproximadamente 100 segundos após o ferimento. Este experimento deve ser realizado sob condições controladas por temperatura e umidade, pois são elevados por mudanças nestas condições ambientais.
Este protocolo oferece um potencial para fornecer insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à sinalização de longa distância através do uso de mutantes que os elementos defeituosos e putativos do sistema de sinalização de laboratório.
