يسمح هذا البروتوكول بالتصوير في الوقت الحقيقي على مستوى النبات لنشاط نظام الإشارات الجهازية النباتية من خلال مراقبة ديناميكيات الغلوتامات الكالسيوم والأبوبلاستي استجابة للإصابة. توفر طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات هذه أداة قوية لفهم ديناميكيات الإشارات السريعة والطويلة المسافة في النباتات ، والجمع بين الدقة الزمنية المكانية العالية وسهولة الاستخدام. يوفر هذا البروتوكول إمكانية تقديم نظرة جديدة على الخصائص المكانية والزمنية للإشارات الكالسيوم النظام في كل من الاستجابات الإجهاد الحيوي والأحيائي في الأنواع الأخرى من النباتات.
إثبات الإجراء سيكون تاكويا أويمورا، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بتشغيل مجهر ستيريو فلوري مزود بعدسة 1X الهدف وكاميرا sCMOS. تكوين إعدادات الجهاز لتشعيع مع ضوء الإثارة تركزت على 470 نانومتر، التي تم اختيارها باستخدام مرشح ينقل الضوء بين 450 و 490 نانومتر.
الحصول على ضوء الانبعاثات باستخدام مرشح ينقل ما بين 510 و 560 نانومتر. إزالة الغطاء من الطبق الذي يحتوي على النبات ووضعه تحت العدسة الهدف. تحقق من إشارة الفلورسنت من المصنع.
ثم انتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا في الظلام حتى يتم تكييف النباتات مع الظروف البيئية الجديدة. ضبط التركيز والتكبير لرؤية المصنع كله في مجال الرؤية. ثم تعيين معلمات الاستحواذ للكشف عن إشارات الفلورسنت باستخدام برنامج التصوير المجاهر.
تعيين وقت التسجيل إلى 11 دقيقة. صورة لمدة خمس دقائق قبل بدء التجربة لتأقلم النبات مع تشعيع الضوء الأزرق من المجهر ، ثم بدء التسجيل. لتحديد متوسط سجل مضان خط الأساس على الأقل 10 إطارات قبل الجرح أو تطبيق الغلوتامات.
للتصوير في الوقت الحقيقي من الجرح الناجم عن أيون الكالسيوم الخلوية وتغيرات تركيز الغلوتامات المبرمج، وقطع بيتيول أو المنطقة الوسطى من ورقة L1 مع مقص. للتصوير في الوقت الحقيقي من الغلوتامات أثار تغييرات الكالسيوم السيتوسوليك، وقطع ما يقرب من ملليمتر واحد من غيض من ورقة L1 عبر الوريد الرئيسي مع مقص. بعد 20 دقيقة على الأقل تطبيق 10 ميكرولتر من الغلوتامات 100 ملليمولار على سطح ورقة قطع.
لتحليل كثافة الفلورية مع مرور الوقت، حدد منطقة الاهتمام في المكان الذي سيتم فيه تحليل كثافة الفلورسينس. حدد اثنين من ROIs لحساب سرعة موجة الكالسيوم. في برنامج التصوير انقر على قياس الوقت، وتحديد ودائرة.
قياس المسافة بين المنطقتين من خلال النقر على الشروح والقياس والطول والخط البسيط. قياس قيم فلوريسينس الخام في كل عائد الاستثمار مع مرور الوقت عن طريق النقر على قياس، ثم تصدير البيانات الخام إلى برنامج جدول البيانات، لتحويل إشارة الفلورسنت إلى أرقام في كل نقطة زمنية. حدد قيمة الفلورسينس الأساسية، التي تم تحديدها ك F صفر، عن طريق حساب متوسط F على الإطارات العشرة الأولى في البيانات المسجلة، ثم تطبيع بيانات F كما هو موضح في مخطوطة النص.
لتحليل موجة سرعة الكالسيوم، حدد نقطة ارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا على أنها تمثل اكتشاف زيادة الكالسيوم في كل عائد استثمار. حساب الفرق الزمني في زيادة الكالسيوم بين اثنين من ROIs والمسافة بينهما لتحديد سرعات أي موجة الكالسيوم. يظهر هنا انتشار التغير الناجم عن الجرح في تركيزات أيون الكالسيوم الخلوي والغلوتامات المبرمج.
قطع petiole من ورقة في النباتات التي تعبر عن GCaMP-3 أدى إلى زيادة كبيرة في الكالسيوم. تم تحريضه محليا ثم انتشر في جميع أنحاء الأوعية الدموية. تم نشر الإشارة بسرعة إلى الأوراق المجاورة في غضون بضع دقائق.
عند قطع ورقة والنباتات التي تعبر عن الشتيناسي الأساسية أنا شم الغراء، لوحظت زيادة الغلوتامات المبرمج السريع في جميع أنحاء منطقة القطع. في غضون بضع دقائق، انتشرت الإشارة أيضا من خلال الأوعية الدموية. للتصوير في الوقت الحقيقي لنشر إشارة الكالسيوم الناجمة عن تطبيق الغلوتامات، تم قطع حافة ورقة في النباتات التي تعبر عن CCaMP-3.
تسبب هذا في زيادة تركيز أيونات الكالسيوم الخلوية المحلية ، ولكن الإشارة اختفت في غضون بضع دقائق. بعد ما يقرب من 10 دقائق، تم تطبيق الغلوتامات على سطح القطع، مما تسبب في زيادة محلية سريعة في تركيز الكالسيوم الخلوي ومن ثم نشر هذه الإشارة إلى أوراق القاصد. لقياس التغيرات داخل تركيز الكالسيوم الصلب الناجم عن الجرح في ورقة الجهازية، تم قياس تغيير المسار الزمني لكثافة إشارة GCaMP-3 في منطقتين من المناطق ذات الاهتمام.
تم قياس تغيرات تركيز الغلوتامات المبرمج استجابة للتلف الميكانيكي أيضا. أظهر توقيع الغلوتامات ذروة واحدة في حوالي 100 ثانية بعد الإصابة. وينبغي إجراء هذه التجربة في ظل ظروف يتم التحكم فيها في درجات الحرارة والرطوبة لأنها مرتفعة بسبب التغيرات في هذه الظروف البيئية.
يوفر هذا البروتوكول إمكانية توفير رؤى حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء إشارات لمسافات طويلة من خلال استخدام المسوخ التي العناصر المعيبة والم المفترضة لنظام الإشارات المختبرية.
