Questo protocollo consente l'imaging in tempo reale a livello vegetale dell'attività del sistema di segnalazione sistemica vegetale attraverso il monitoraggio della dinamica del glutammato di calcio e apoplastico in risposta al mento. Questo metodo di imaging in tempo reale a livello di impianto fornisce uno strumento robusto per comprendere la dinamica dei segnali rapidi e a lunga distanza nelle piante, combinando un'elevata risoluzione temporale spaziale e facilità d'uso. Questo protocollo offre il potenziale per fornire una nuova visione delle caratteristiche spaziali e temporali del sistema di segnalazione del calcio sia nelle risposte di stress biotico che abiotico in altre specie di piante.
A dimostrare la procedura sarà Takuya Uemura, un dottoranda del mio laboratorio. Inizia accendendo il microscopio stereo fluorescente motorizzato, dotato di un obiettivo 1X e di una fotocamera sCMOS. Configurare le impostazioni del dispositivo per l'irradiazione con luce di eccitazione centrata su 470 nanometri, selezionata utilizzando un filtro che trasmette luce tra 450 e 490 nanometri.
Acquisire luce di emissione utilizzando un filtro che trasmette tra 510 e 560 nanometri. Rimuovere il coperchio dal piatto contenente la pianta e posizionarlo sotto l'obiettivo. Controllare il segnale fluorescente dalla pianta.
Quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non sono adattate alle nuove condizioni ambientali. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Quindi impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali fluorescenti utilizzando il software di imaging al microscopio.
Impostare il tempo di registrazione su 11 minuti. Immagine per cinque minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio, quindi iniziare a registrare. Per determinare la media della fluorescenza basale registrare almeno 10 fotogrammi prima del rilevamento o dell'applicazione del glutammato.
Per l'imaging in tempo reale dello ione calcio citosolico indotto dalla ferita e dei cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici. Per l'imaging in tempo reale del glutammato ha innescato cambiamenti di calcio citosolico, tagliare circa un millimetro dalla punta della foglia L1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti applicare 10 microlitri di glutammato millimolare sulla superficie tagliata della foglia.
Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza. Definire due ROM per il calcolo della velocità dell'onda di calcio. Nel software di imaging fare clic sulla misurazione del tempo, definire e cerchiare.
Misurare la distanza tra le due regioni facendo clic su annotazioni e misure, lunghezza e linea semplice. Misurare i valori di florescence grezzi in ogni ROI nel tempo facendo clic sulla misura, quindi esportare i dati grezzi nel software del foglio di calcolo, per convertire il segnale fluorescente in numeri in ogni punto di tempo. Determinare il valore di fluorescenza di base, che è intuito come F zero, calcolando la F media sui primi 10 fotogrammi nei dati registrati, quindi normalizzare i dati F come descritto nel manoscritto testuale.
Per l'analisi delle onde di velocità del calcio, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati come rappresentazione del rilevamento di un aumento del calcio in ogni ROI. Calcola la differenza di tempo nell'aumento del calcio tra le due ROM e la distanza tra loro per determinare le velocità di qualsiasi ondata di calcio. La propagazione di un cambiamento innescato da ferite nelle concentrazioni dello ione calcio citosolico e del glutammato apoplastico è mostrata qui.
Tagliare il picceolo di una foglia nelle piante che esprimono GCaMP-3 ha portato a un aumento significativo del calcio. È stato indotto localmente e poi diffuso in tutta la vascucolatura. Il segnale si propagava rapidamente alle foglie vicine in pochi minuti.
Dopo aver tagliato una foglia e piante che esprimono lo sniffer di colla chitinasi I di base, è stato osservato un rapido aumento del glutammato apoplastico intorno alla regione tagliata. Nel giro di pochi minuti, il segnale si propagava anche attraverso la vascucolatura. Per l'imaging in tempo reale della propagazione del segnale di calcio innescata dall'applicazione del glutammato, è stato tagliato il bordo di una foglia nelle piante che esprimono CCaMP-3.
Ciò causò un aumento della concentrazione locale di ioni di calcio citosolico, ma il segnale scomparve in pochi minuti. Dopo circa 10 minuti, il glutammato è stato applicato sulla superficie tagliata, causando un rapido aumento locale della concentrazione di calcio citosolico e quindi la propagazione di questo segnale alle foglie distali. Per misurare i cambiamenti all'interno di una concentrazione solida di calcio indotta dallo ingrato nella foglia sistemica, il cambio di rotta del tempo dell'intensità del segnale GCaMP-3 è stato misurato in due regioni di interesse.
Sono stati misurati anche i cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico in risposta ai danni meccanici. La firma del glutammato mostrava un singolo picco a circa 100 secondi dopo il mento. Questo esperimento deve essere condotto in condizioni controllate da temperatura e umidità perché sono elevati da cambiamenti in queste condizioni ambientali.
Questo protocollo offre un potenziale per fornire informazioni sui meccanismi molecolari alla base della segnalazione a lunga distanza attraverso l'uso di mutanti che gli elementi difettosi e putativi del sistema di segnalazione di laboratorio.
