פרוטוקול זה מפחית את המורכבות הטכנית ואת הזמן הנדרשים להעשרת שלפוחיות חוץ-תאיות משחפת Mycobacterium, Mtb EVs. הוא מספק אלטרנטיבה עדינה לטכניקות מסורתיות מבוססות אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי קל לבצע, מה שהופך אותו יותר לשכפל.
הוא מספק תפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עם העשרה משותפת מינימלית של חלבונים שאינם EV. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ואני ראיין, סטודנטית לשעבר לתואר שני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכן מסנן צנטריפוגלי בעל משקל מולקולרי של 100 קילודלטון על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של PBS.
צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס. בטל את הזרימה ואת כל ה- PBS הנותר, ומלא את תא הדגימה ב- Mtb CFP עד לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב 2, 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס עד נפח מופחת לנפח המינימלי של מכשיר אולטרה סינון.
יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד שהדגימה כולה צומצמה במידה מספקת. הוסף 1X PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת המכשיר הכוללת. הפחיתו את עוצמת הקול כפי שתואר קודם לכן וחזרו על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת מאגרים.
לאחר מכן, לשחזר את 100 קילו קילודלטון מרוכז CFP retentate או 100R, על פי מפרט מכשיר ultrafiltration. שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1X PBS לפחות שלוש פעמים, ומשכו את הכביסה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות. השתמש במספר דילול של דגימות ב- PBS וכמות החומר 100R עם בדיקה bicinchoninic.
בדוק את המדגם במשולש. אפשר לכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל, או עמודת ה-SEC, להתאזן לטמפרטורת החדר. הפעל את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בגב יחידת המגדל ולחץ על Setup במסך המגע של התפריט הראשי במידת הצורך כדי להתאים את ההגדרות עבור תא הטעינה.
ממסך ההתקנה, יישר את הקרוסלה על-ידי בחירת קרוסלה ואחריה כיול. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה לתוך מגדל AFC וכוונן את הקרוסלה על ידי לחיצה על כפתורי המינוס או הפלוס כך שהזרבובית הנוזלית תהיה ישירות מעל מיקום הסומק. הסר את האותיות הקטנות מעמודת ה- SEC המאוזנת והחלק את עמודת ה- SEC לתוך תושבת העמודה המתאימה.
התקן אותו בזהירות על מגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו בעמודה פונה ל-AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. הניחו את צינורות שקע הפסולת במיכל איסוף.
ממסך ההתקנה, בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מיליליטר על ידי לחיצה על לחצני המינוס או הפלוס. השאר את הגדרת עוצמת הקול של המאגר כברירת המחדל של 2.7 מיליליטר ולאחר מכן סגור את חלון לוח הזמנים לאיסוף. בחר התחל איסוף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה באפשרות כן.
טען 13 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר עם המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה. קדם את AFC על-ידי בחירה באפשרות אישור, ולאחר מכן טען את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לרוקן את העמודה על-ידי הקשה על כן, והוסף נפח עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת הסומק, קדם את ה- AFC על ידי לחיצה על OK. הנח את כיסוי הקרוסלה מעל AFC ולחץ על OK. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף מהעמודה.
הביאו שלושה מיליגרם של דגימת 100R ל-500 מיקרוליטרים עם 1X PBS והוסיפו את הדגימה לראש העמודה. הכן נפח עמודה אחת של PBS מסונן 0.2 מיקרומטר. קדם את ה- AFC ואפשר לדגימה לרוץ לתוך הדאגה.
לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את ה- PBS שהוכן קודם לכן למאגר. עקוב אחר ההפעלה של AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את אמצעי האחסון הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר שהריצה מסתיימת והקרוסלה חוזרת למצב הפסולת, הסר את הכיסוי ואת צינורות השבר מהקרוסלה.
עבור שברים של 0.5 מילימטרים שנאספו משלושה מיליגרם של 100R Mtb CFP, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות מיקרו-BCA עם דילול של 1:3 עבור שברים הממוספרים 1 עד 7 מכל דגימה במשולש. עבור שברים של 0.5 מיליליטר הממוספרים 5 עד 13, השתמש ב- BCA ללא דילול עבור כל דגימה במשולש. הוסף מאגר דגימת SDS ל-10 מיקרוליטרים מכל שבר וחמישה מיקרוגרם של CFP ו-100R.
מרתיחים במשך חמש דקות ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען על ג'ל 4 עד 12% Bis-Tris עם סולם משקל מולקולרי עבור אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, או PAGE. הפעל ג'ל SDS-PAGE באמצעות מאגר פועל 1X MES וזרם של 200 וולט למשך 35 דקות.
הסר את הג'ל מן הקלטת ולהחיל זרם 50 וולט במשך שעה אחת לפחות כדי להעביר את החלבונים נפתרו לקרום ניטרוצלולוז 0.2 מיקרומטר. לבסוף, בצע את ניתוח הכתם המערבי כדי להעריך את החלבונים. ג'ל SDS-PAGE המוכתם בכסף מדגים את פרופיל החלבון הכולל עבור כל שבר.
הנתונים מראים כי השברים המאוחרים יותר מכילים יותר חלבון ודומים לחומר 100R. כתמים מערביים המזהים LAM, LpqH ו-GroES מראים כי סמן החלבון משתנה על פני השברים. מיקרוסקופיית אלקטרונים של הולכה, או תמונות TEM, של שברים SEC 1 עד 3 שנמשכו לפני הקיבוע מוצגות כאן.
האולטרה-צנטריפוגציה של מעבר הצפיפות של כלי רכב חשמליים Mtb הוכתמה באופן שלילי עבור הדמיית TEM. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או התפלגות NTA, של שברים SEC 1 עד 3 מוצג כאן. כלי הרכב החשמליים מסוג Mtb של אולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע צפיפות נותחו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, והתפלגות הגודל מוצגת כאן.
פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לטיהור EV משלושה מיליגרם של 100R. אם עומס החלבון מגוון, אסטרטגיית הדילול וה-BCA המומלצים על שברים המתקבלים עשויים לדרוש התאמה. רכבים חשמליים Mtb שהוכנו בטכניקה זו יכולים לשמש למחקרים מבוססי קומפוזיציה במורד הזרם ומבוססי אומיקה.
הם מתאימים גם לניסויים in vitro ו- in vivo. טכניקה זו מספקת דרך יעילה ויעילה לייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה, וסוללת את הדרך לשכפול מוגבר בניסויים עתידיים של Mtb EV.
