The authors would like to acknowledge Shelly Xie and Jennifer Payne for their expert technical assistance. This work was made possible through grants from the Society of Pediatric Urology and the Stanford Pediatric Research Fund.

I. הכנה של צנתרים השופכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל שלפוחית ​​השתן העכבר כליה להיות שנדגמו, מקום 5-6 חרוזים נירוסטה (שלפוחית ​​השתן, בגודל 1.6 מ&quot;מ או תערובת 0.9-2.0 מ&quot;מ) או חרוזים זירקוניום אוקסיד (כליות בגודל 0.5 מ&quot;מ) הגליל האחד cryovial, בהתאמה. החיטוי חרוז המכילים צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורות להתקרר לטמפרטורת הסביבה, להוסיף 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור נירוסטה חרוז המכילים ו 400 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור זירקוניום אוקסיד חרוז המכילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מכינים קטטר השופכה כפי שתואר על ידי Hung ו Hultgren 13. החיטוי זוג נקי של שטוח ראש מלקחיים ומספריים קנס (איריס או סוג דומה) ולאפשר המכשירים להתקרר לטמפרטורת הסביבה. נגבו את פני השטח של ברדס למינרית לזרום עם אתנול 70%. בשכונה, חתך 30 ס&quot;מ (בקירוב) קטע של צינורות פוליאתילן. בסביבה נקייה מחיידקים, במקום מחט סטרילית 30 מד (מחט ארוכה 1 / 2 אינץ&#39;) על מזרק 3 סמ&quot;ק סטרילי. להרים קצה אחד של צינורות פוליאתילן לחתוך עם מלקחיים autoclaved והחלק את צינור אל המחט עד שהוא פוגש את הרכזת. חותכים את צינורות כך כ 2 ס&quot;מ חורג קצה המחט. הסר את הקטטר מן המזרק ומניחים בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקטין את הסבירות של זיהום צולב, אנו לעשות אחד קטטר עבור כל עכבר. אחרי הכל צנתרים נעשים, לעקר מהם על ידי חשיפה בצלחת פטרי חשפו קרינה UV במשך 30 דקות לפחות. אל תסתכל ישירות על מנורות UV או לחשוף כל חלק של הגוף בשכונה בעוד מנורות מופעלים. לאחר החשיפה UV, צנתרים ניתן לאחסן לטווח ארוך בצלחת פטרי. אנו ממליצים איטום צלחת עם Parafilm כדי לעזור לשמור על סטריליות. </li></ol> השנייה. בעלי חיים הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכברים צריכים להגיע לפחות שבוע לפני מניפולציה ניסויית על מנת למנוע מתח המושרה גורמים סותרים. עכברים נקבה משמשים כי השופכה עכבר זכר קשה מאוד קטטר. CBA / J הוא מנוצל בדרך כלל, UTI-רגישים למתח עכבר מולדת. עכברים אמור לשמש בין 8 ל 12 שבועות של גיל, שכן זהו חלון של בגרות החיסונית לקראת ההזדקנות. ביום הראשון של הניסוי, לטבול את קצה לולאה inoculating סטרילי לתוך בקבוקון של מלאי חיידקים קפואים. לגרד inoculum קטן החוצה פס בצלחת אגר המתאים. באופן כללי, uropathogenic E. coli (UPEC) ו זנים אחרים ניתן לגדל לילה בשעה 37 על אגר (LB) לוריא-Bertani מעלות הסביבה האוויר. זנים UPEC לגדול כמו מוצק, לבן צהבהב שקוף מושבות על אגר LB. מיד להחזיר את מלאי החיידקים למקפיא. זני חיידקים Uropathogenic יכול להיות ארסית פחות לאורך זמן עם תרבויות חזר סדרתי. לפיכך, אנו ממליצים פסים צלחת אגר טרי עבור כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 של הניסוי, לאחר אישור מורפולוגיה המושבה נכונה, לבחור אחת מן המושבות צלחות אגר ומניחים סמ&quot;ק לפחות 5 התרבות מרק לילה. מרק LB יכול לשמש זני חיידקים uropathogenic ביותר (37 ° C, 200 סל&quot;ד בתוך הסביבה האוויר). שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 של הניסוי, לקחת 10% של התרבות מרק התרבות הראשון במרק לילה שוב (בדרך כלל 37 ° C ו סל&quot;ד 200), כדי לשפר את סוג הביטוי אני פילי. תרבויות מרק סידורי לעזור כדי לייעל uropathogenicity בקטריאלי, שכן סוג אני פילי הוכחו להיות גורם קריטי עבור ארסיות uropathogens in vivo 1. שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 של הניסוי, למדוד את OD 600 של התרבות מרק מיום 3. אם לא ידוע כבר זן חיידקי נבדק, לבצע פי עשרה ציפוי דילול סדרתי על לפחות 7 יומנים (דילולים הופיע עם PBS, תרבויות שבוצעו על אגר LB, 37 ° C הדגירה לילה) כדי לקבוע את הקשר בין OD 600 ו CFU / ml. ככלל אצבע, OD של 600 0.4-0.5 כלל מתאים CFU 1 2x10-7 ל 50 מיקרוליטר. לאחר מערכת היחסים בין OD 600 ו CFU / ml נקבע, ניתן להתאים את התרבות מרק ל OD 600 המתאים CFU הרצוי לכל העכבר 50 מיקרוליטר של PBS. עבודה חלק הציעו כי חיסון של 10 מיקרוליטר, במקום 50, המוביל ריפלוקס פחות לתוך kidneys6. עם זאת, רוב הפרסומים דיווחו על שימוש של 50 מיקרוליטר לכל עכבר. ככלל, טווחי CFU הרצוי בין 10 ו - 6 108 CFU / עכבר, אבל כל שילוב זן חיידקי / עכבר צריך להיבדק באופן אמפירי in vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח inocula לא ביטל מיד לאחר החדרה, עכברים יש לשלול מים במשך לפחות 30 דקות לפני אינדוקציה של הרדמה כללית. עוד תמרון המפתח הוא לגרום הרקה לפני הגיוס הרדמה ידי scruffing עכברים בעדינות לחיצה על abdom נמוךen. שני עד 2.5% isoflurane הוא מנה אינדוקציה בטוח 8-12 בן שבוע נקבות עכברים CBA, ואחריו הרדמה תחזוקה עם 1.8-2% isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה מושגת, עכברים ממוקמים בעמדה פרקדן עם הראש שלהם הוכנס nosecone המחובר חמצן isoflurane המכילים. הבטן התחתונה היא עיסה לפנות את השתן משלפוחית ​​השתן. אם השלפוחית ​​ריקה יחסית, התמרון הזה לא עשוי להניב שתן. בבטן התחתונה חיץ הנקבים ספוגה אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק סטרילי 1 סמ&quot;ק ללא מחט משמש כדי למשוך את inoculum חיידקי הרצוי. בשלב הבא, קטטר השופכה סטרילי ממוקם בסביבה נקייה מחיידקים, על המזרק. צינורות עודף לנתק את הקטטר עם זוג מספריים, כך שרק 1-2 מילימטרים של צינורות נותרים דיסטלי אל קצה המחט. ואז, המזרק הוא טפח ואת הבוכנה מדוכא עם המזרק זקוף כדי להסיר את כל הבועות. מנה של סיכה bacteriostatic ג&#39;לי הוא ניתז על גבי צלחת פטרי סטרילית או את החלק הפנימי של עטיפת מזרק סטרילי. בקצה הקטטר (עם מזרק המצורף) הוא טבל את ג&#39;לי. אם זני חיידקים מרובות נבדקות בניסוי אותו, להיזהר שלא להשתמש ירידה זהה של ג&#39;לי לשמן צנתרים המכיל זנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאופוני (0.8x טווח זום 5x) עבור ההגדלה, מכסה מנוע הדגדגן של העכבר הרדים הוא תפס בעדינות עם זוג נאה שיניים מלקחיים ביד הלא דומיננטי והעלה cephalad לחשוף את meatus השופכה ורוד עמוק ( איור 1). מזרק (עם קטטר המצורפת) הוא תפס ביד הדומיננטית עם אחיזת עיפרון בקצה הקטטר עוסקת meatus השופכה בזווית של 45 מעלות. מכסה המנוע הדגדגן נמתח לאורך ציר זמן של המזרק, ביעילות &quot;טוען&quot; את השופכה על הקטטר. תמרון זה חיוני מאז השופכה העכבר הוא מיותר. קטטר צריכה להחליק בקלות לתוך שלפוחית ​​השתן (עד הרכזת, איור 2), והוא יכול להיות סובב בעדינות כדי לעזור לנווט את קפלי מיותר של השופכה. לאחר קטטר הוא hubbed, המזרק ניתן להוריד עד שהוא מקביל עם ציר האורך של העכבר. היד הלא דומיננטית יכולים להוריד את המלקחיים כדי לעזור לייצב את המיקום של קטטר ו מזרק כמו היד הדומיננטית משמש לאט להזריק את inoculum (לפחות 5 שניות). אם הנוזל הוא ראה זורם סביב הקטטר במהלך ההזרקה, או שלפוחית ​​השתן מלאה או קטטר הוא בתוך הנרתיק (הזנב רק כדי השופכה). הזרקת יש להפסיק מיד את מיקומו של הקטטר לבחון היטב. אם הקטטר היה השופכה, העכבר לא ניתן לכלול בניסוי. מצד שני, קטטר במקומה בנרתיק יכול להיות מיקומו ואת הזריקה מחדש ניסו. לאחר ההזרקה, קטטר ואת המזרק היא נסוגה לאיטה מן העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקטין את הסיכוי של הרקה שלאחר חיסון מוקדם, שעשוי לפנות מנוהל חיידקים, ובכך להוביל רמות זיהום משתנה, חוקרים מסוימים לשמור על עכברים תחת הרדמה במשך 30 דקות לאחר inoculation10 transurethral. לאחר הניתוח, עכברים צריך להתאושש על שמיכה מחממת נקי עם תצפית רציפה כדי לאשר שובו של דפוסי נשימה נורמלי פעילות. לאחר חיות התאוששו באופן מלא את היכולת לזחול, הם עשויים להיות חזר מצעים המכילים בכלובים. </li></ol> ג. CFU מדידת ברקמה מאשרום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר פרסומים שונים UTI דיווחו על תוצאות של תרבות 6 שעות בשבוע אחד או יותר לאחר חיסון. נקודות זמן אופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי עבור שילוב זן חיידקי כל / עכבר. שתן מבוטלות מתקבל לתרבות ידי scruffing העכבר מעל צלחת פטרי סטרילית. השתן שנאסף יש לשמור על הקרח בכל עת. ניסיונות מרובים להשיג שתן בטלה על פני שעות רבות עשוי להיות נחוץ, שכן הרקה העכבר נפח תכופים, נמוך (3-10 מיקרוליטר לכל חלל), מתח תלויי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השגת דגימות שתן בטלה, אנו להקריב בעכברים באמצעות פריקה isoflurane ואת צוואר הרחם. הבטן היא פתחה בסביבה נקייה מחיידקים. אם דגימת שתן בטלה לא התקבל בהצלחה קודם לכן, כמות קטנה של שתן לעתים קרובות ניתן aspirated דרך הקיר שלפוחית ​​השתן באמצעות מחט מד מזרק 30 ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת או שתי הכליות מוסרים, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות (כל חתיכה צריכה להיות פחות מ 50 מיקרוגרם) על צלחת פטרי סטרילית, והניח לתוך חרוז זירקוניום / PBS המכילים cryovials על הקרח. שלפוחית ​​השתן מוסר, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות, מכניסים נירוסטה חרוז / PBS המכילים cryovials על הקרח. רקמה / חרוזים / PBS המכילים cryovials ממוקמים כדור בלנדר homogenizer ואת רקמות הומוגני באמצעות &quot;8&quot; קביעת מהירות למשך דקה אחת. זה נפוץ כמה קטעי רקמות להישאר אחרי homogenization. כל עוד 5-10 מיקרוליטר של homogenate נוזלי ניתן pipetted, שברי מוצקהם לא בהכרח בעיה. אם הזמן הוא גדל homogenization עבור כמה דוגמאות, חשוב לעשות זאת במשך כל רקמות על מנת לשמור על עקביות של homogenization. אנו מנצלים כדור בלנדר homogenizer כי זה ימנע את האפשרות של זיהום צולב, היא מהירה יותר מאשר עיבוד דגימות בודדות אחד אחד באמצעות homogenizer רגיל, ואינו משמעותי החום דגימות להיות הומוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות שתיים או שלוש עשרה לקפל דילולים של שתן שנאספו homogenates רקמות צריכים להיעשות צלחת microtiter. בניסויים ראשוניים זה עשוי להיות נבון כדי להפוך לפחות שבעה פי עשרה דילולים. תרבות עד 100 מיקרוליטר של שתן, שלפוחית ​​השתן, ו / או homogenates כליה על אגר המתאים. מאז דגימות שתן עשוי להיות נפח מוגבל, ייתכן שיהיה צורך להביא כרכים שלהם 100 מיקרוליטר לפני ביצוע פי עשרה דילולים. אם זה נדרש, דילול ראשוני (לפני דילול פי עשרה) יהיה צורך בחשבון חישובים הסופי של התשואות חיידקי. אנחנו מעדיפים UPEC culturing על eosin-מתילן כחול או אגר MacConkey (הדגירה לילה בשעה 37 ° C), שכן התקשורת אלה סלקטיבית של אורגניזמים גראם שליליים. זנים UPEC גדלים על אגר MacConkey כמו umbilicated מרכזי, אדום ורוד מושבות בשל יכולתם להתסיס לקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לילה תרבות, לספור את CFU עבור כל צלחת. לקבלת דוגמיות בדילול סדרתי, הדילול צלחת ובה 50-100 מושבות נחשבת ספירה מדויקת ביותר. &quot;חזרה&quot; לחשב CFU לכל רקמה, מיליגרם של רקמות, או לכל מ&quot;ל. </li></ol> IV. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Meatus השופכה (רקמה ורוד כהה) שנחשפו על ידי הרמת מכסה המנוע הדגדגן cephalad עם מלקחיים (מעבר גבי צילום) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. צינתור השופכה. הדגדגן bifid ניתן לראות בדיוק מעל הקטטר. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שלפוחית ​​השתן CFU ספירת 2 ימים לאחר ההדבקה transurethral של 8 שבוע הישן CBA / י נקבות עכברים עם uropathogenic E. coli. שלפוחיות היו הומוגני ו CFU / ml נקבע על ידי ציפוי דילול סדרתי על אגר MacConkey. יהלומים מצביעים CFU / ml עבור עכברים בודדים, הפס האופקי מציין CFU חציון / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli.">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li><li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract.">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li><li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies.">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li><li>Gunther, N. W. t., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection.">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li><li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells.">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li><li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder.">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li><li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending,+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin.">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Induction of mouse urinary tract infection by transurethral inoculation of bacteria is a long-established but technically demanding procedure11. Hung and Hultgren recently published an excellent review of transurethral techniques of mouse urinary tract infection13. In this paper, we attempt to further illustrate the finer points of this experimental approach.

Novices may practice their technique by performing a midline laparotomy to expose the bladder, injecting a dilute solution of India ink (1% in PBS), and observing for blue coloration of the bladder. We have found that a full bladder is one of the most difficult problems to deal with during mouse urethral injection, and is best prevented by the water deprivation and pre-anesthesia voiding strategies outlined above. In our hands, &lt;10% of mice exhibit overflow of urine during urethral injection. Another potential stumbling block is traumatic catheterization, which can lead to urethral perforation, improper doses of bladder inocula, and even animal death. Gentle technique and patience are key during catheterization; successful catheterization should never require forcing the catheter into the bladder.

Finally, some laboratories may not wish to use a Bullet Blender homogenizer or other "medium throughput" homogenizer, either due to low sample numbers or cost considerations. An intermediate solution is to use a standard homogenizer and clean the device between each sample. The most economical solution is use of glass grinders, which we successfully employed prior to switching to the Bullet Blender homogenizer. Regardless of the tissue homogenization method used, meticulous, aseptic, and consistent technique are crucial to obtaining reproducible results.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

Watch this Scientific Journal Video about Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection at JoVE.com

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K Views.  Stanford University. This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections. 

Video: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

הליך ההתקנה-transurethral עכבר זכר בוגר

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major manifestation of S. suis infections. A suitable infection model is an essential tool to understand the mechanisms of diseases caused by pathogens. Several routes of infection in mice have been developed to study the pathogenesis of S. suis infection. However, the intraperitoneal, intranasal, and intravenous routes of infection are not suitable for studying the roles of S. suis surface components in meningitis directly in the brain, such as the extracellular matrix from biofilms. Although intracisternal inoculation has been used for S. suis infection, the precise injection site has not been described. Here, the intracranial subarachnoidal route of infection was described in a mouse model to investigate the roles of biofilms in S. suis meningitis. S. suis planktonic cells or biofilm state cells were directly injected into the subarachnoid space of mice through the injection site located 3.5 mm rostral from the bregma. Histopathological analysis and increased mRNA expression of TLR2 and cytokines of the brain tissue from mice injected with biofilm state cells clearly indicated that S. suis biofilm plays definitive roles in S. suis meningitis. This route of infection has obvious advantages over other routes of infection, allowing the study of the host-bacterium interaction. Furthermore, it permits the effect of bacterial components on host immune responses directly in the brain to be assessed, and mimics bacterial entrance into the central nervous system. This route of infection can be extended for investigating the mechanisms of meningitis caused by other bacteria. In addition, it can also be used to test the efficacy of drugs against bacterial meningitis.

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Here, we describe the intracranial subarachnoidal route of infection in mice to study roles of biofilms in Streptococcus suis meningitis. This infection model is also suitable for studying the pathogenesis of other bacterial meningitis and the efficacy of new drugs against bacterial meningitis.

Subarachnoidal תוך-גולגולתי, תוואי זיהום עבור חוקרים התפקידים של סטרפטוקוקוס suis Biofilms ב דלקת קרום המוח במודל זיהום של עכברים

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...