Unsere Methode ermöglicht die schnelle Charakterisierung genetischer Teile mittels zellfreier Expressionssysteme und PCR anstelle von Klonen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das, was in Zellen typischerweise Tage bis Wochen dauert, mit dieser Methode in Stunden bis Tagen erledigt werden kann. Unser Protokoll enthält Schritte, um Ihre eigenen zellfreien Expressionssysteme zu erstellen, die an verschiedenen Stellen schwierig sein können und je nach Anwendungsfall Anpassungen erfordern können.
Wenn Sie zum ersten Mal anfangen, empfehlen wir, mit kommerziellen Kits zu beginnen. Bereiten Sie zunächst die PCR-Mastermischung gemäß den Anweisungen im Manuskript vor und lagern Sie sie auf Eis. Aliquot werden 30 oder 40 Mikroliter des Masters in die bestimmte Anzahl von PCR-Röhrchen gemischt und 10 Mikroliter von jeweils fünf mikromolaren variablen Primern in entsprechend markierte PCR-Röhrchen gegeben.
Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das PCR-Programm wie im Textmanuskript beschrieben aus. Halten Sie dann die Reaktionen bei vier Grad Celsius. Wenn es sich bei der ursprünglichen Vorlage um Plasma-DNA handelt, fügen Sie einen Mikroliter DpnI-Restriktionsenzym hinzu, um die ursprüngliche Vorlage zu verdauen, und inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Analysieren Sie fünf Mikroliter jedes PCR-Produkts, indem Sie sie 20 Minuten lang mit einem 1%igen Agarose-Gel bei 180 Volt trennen. Überprüfen Sie die richtige Bandgröße, die mit der gewählten Kernsequenz und der Länge der hinzugefügten Teile variiert. Reinigen Sie die linearen Schablonen mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit.
Wenn mehrere Banden durch Gelelektrophorese vorhanden waren, schneiden Sie die interessierenden Banden aus dem Gel aus und reinigen Sie die DNA mit einem handelsüblichen Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren Sie jede DNA-Vorlage mit einem Spektralphotometer und bewerten Sie ihre Qualität, indem Sie überprüfen, ob das Verhältnis von 260 zu 280 Nanometern ungefähr 1,8 beträgt. Tauen Sie alle Komponenten auf Eis auf und bereiten Sie eine Mastermischung vor, indem Sie alle Komponenten gründlich mit einer Pipette mischen, wie im Manuskript erwähnt.
Achten Sie sorgfältig darauf, Ausfällungen zu vermeiden, insbesondere bei der Aminosäuremischung. Halten Sie den Master-Mix auf Eis. Kühlen Sie eine 384-Well-Platte auf Eis und verteilen Sie die Master-Mischung in Neun-Mikroliter-Aliquots in jede Vertiefung.
Tauen Sie das Represserprotein auf Eis auf und verteilen Sie es in eine akustische Liquid-Handling-Quellplatte, wobei sichergestellt wird, dass die für den verwendeten Plattentyp erforderliche Menge an Totvolumen enthalten ist. Verteilen Sie das Represserprotein in einem Mikrolitervolumen über den Liquid Handler in die entsprechenden Zielwellen. Fügen Sie eine serielle Verdünnung des gereinigten Reporters oder einen geeigneten chemischen Standard auf die Platte auf, um die Ergebnisse mit anderen Studien und anderen Labors zu vergleichen.
Wählen Sie einen Konzentrationsbereich, der für den Reporter geeignet ist, der im erwarteten Expressionsbereich der Experimente verwendet wird. Heizen Sie den Plattenleser auf 30 Grad Celsius vor. Wenn möglich, stellen Sie am Gerät einen vertikalen Temperaturgradienten von einem Grad Celsius ein, um die Kondensation auf der Dichtung zu begrenzen.
Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er mit den Einstellungen liest, die für den in der Kernsequenz verwendeten Reporter geeignet sind, ohne die Schritte zu schütteln. Versiegeln Sie die 384-Well-Platte mit einer undurchlässigen Kunststoffdichtung, um Verdunstung zu verhindern. Legen Sie die 384-Well-Platte auf den Plattenhalter und beginnen Sie mit dem Lesen.
15 lineare Schablonen, die sich nur im Abstand des T7-Promotors relativ zur tetO-Sequenz unterscheiden, wurden mittels PCR hergestellt, wobei der Superordner grün fluoreszierender Proteinreporter mit Primern amplifiziert wurde, die jede Promotorvariante hinzufügen sollten. Die Analyse von Daten aus insgesamt 540 Reaktionen für den gesamten Satz von T7-tetO-Kombinationen zeigte, dass die T7-RNA-Polymerase die T7-gesteuerte Expression gleichmäßig herunterreguliert, bis zu 13 Basenpaare stromabwärts vom Beginn des T7-Transkripts. Eine konsistentere Dosierung über die Serie von acht Zielbohrungen unter Verwendung des akustischen Liquid Handlers wurde beobachtet, wenn ein Fünf-Mikroliter-Transfer in separate Ein-Mikroliter-Dosen aufgeteilt wurde.
Unser Protokoll kann verwendet werden, um genetische Komponenten schnell zu screenen, sei es für das Screening neuer Biosensoren oder den Aufbau von Bibliotheken genetischer Teile.
