私たちの方法は、クローニングの代わりに無細胞発現システムとPCRを使用して遺伝子部分の迅速な特性評価を可能にします。この技術の主な利点は、細胞内で通常数日から数週間かかるものが、この方法を使用して数時間から数日で行うことができることである。私たちのプロトコルには、独自の無細胞発現システムを作成するための手順が含まれていますが、これは多くの場所でトリッキーであり、ユースケースによっては調整が必要になる場合があります。
最初に始めるときは、市販のキットから始めることをお勧めします。原稿の指示に従ってPCRマスターミックスを準備し、氷上に保存することから始めます。30または40マイクロリットルのマスターミックスを決定された数のPCRチューブに分注し、適切に標識されたPCRチューブに各5マイクロモル可変プライマー10マイクロリットルを追加します。
PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、テキスト原稿に記載されているようにPCRプログラムを実行します。次に、反応を摂氏4度に保持します。元のテンプレートが血漿DNAの場合は、1マイクロリットルのDpnI制限酵素を加えて元のテンプレートを消化し、摂氏37度で1時間インキュベートします。
各PCR産物の5マイクロリットルを、1%アガロースゲルを使用して180ボルトで20分間分離して分析します。選択したコア シーケンスと追加されたパーツの長さによって異なる正しいバンド サイズを確認します。市販のPCR精製キットを使用してリニアテンプレートを精製します。
ゲル電気泳動で複数のバンドが存在する場合は、製造元の指示に従って、ゲルから目的のバンドを切除し、市販のゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。分光光度計を使用して各DNAテンプレートを定量し、260〜280ナノメートルの比率が約1.8であることを確認して品質を評価します。原稿に記載されているように、すべての成分を氷上で解凍し、すべての成分をピペットで完全に混合してマスターミックスを準備します。
特にアミノ酸混合物については、沈殿を避けるために細心の注意を払ってください。マスターミックスを氷の上に置いておきます。384ウェルプレートを氷上で冷却し、マスターミックスを9マイクロリットルのアリコートで各ウェルに分配します。
リプレッサータンパク質を氷上で解凍し、音響液体処理ソースプレートに分配して、使用するソースプレートのタイプに必要な適切な量のデッドボリュームが含まれていることを確認します。リプレッサータンパク質を1マイクロリットルの容量で、リキッドハンドラーを介して適切な宛先ウェルに分配します。精製レポーターの段階希釈または適切な化学標準をプレートに含めて、結果を他の研究や他のラボと比較します。
実験の予想される発現範囲で使用されるレポーターに適した濃度の範囲を選択してください。プレートリーダーを摂氏30度に予熱します。可能であれば、機器で摂氏1度の垂直温度勾配を設定して、シールの結露を制限します。
プレートリーダーは、ステップを振ることなく、コアシーケンスで使用されるレポーターに適した設定で読み取るように設定します。蒸発を防ぐために、384ウェルプレートを不浸透性のプラスチックシールでシールします。384ウェルプレートをプレートホルダーに置き、読み取りを開始します。
tetO配列に対するT7プロモーターの距離のみが変化する15個の線形テンプレートをPCRによって調製し、各プロモーター変異体を追加するように設計されたプライマーを用いて、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質レポーターを増幅した。T7 tetO結合のセット全体について合計540の反応からのデータを分析したところ、T7 RNAポリメラーゼは、T7転写産物の開始から13塩基対下流まで、T7駆動発現を等しく下方制御することが示されました。音響液体ハンドラーを使用した一連の8つの宛先ウェル間でより一貫した分注が観察されたのは、5マイクロリットルの移送を別々の1マイクロリットルの分注に分割した場合でした。
私たちのプロトコルは、新しいバイオセンサーのスクリーニングや遺伝子部品のライブラリの構築など、遺伝子成分を迅速にスクリーニングするために使用できます。
