Наш метод позволяет быстро охарактеризовать генетические части с использованием бесклеточных систем экспрессии и ПЦР вместо клонирования. Основным преимуществом этой техники является то, что обычно занимает от нескольких дней до недель в клетках, что может быть сделано за несколько часов до нескольких дней с использованием этого метода. Наш протокол включает в себя шаги по созданию собственных бесклеточных систем экспрессии, которые могут быть сложными в ряде мест и могут потребовать корректировки в зависимости от варианта использования.
Когда вы только начинаете, мы рекомендуем начать с коммерческих наборов. Начните с приготовления мастер-микса ПЦР в соответствии с инструкцией в рукописи и храните его на льду. Aliquot 30 или 40 микролитров мастер-микса в определенное количество ПЦР-пробирок и добавляют 10 микролитров каждого из пяти микромолярных переменных праймеров к соответствующим образом маркированным ПЦР-трубкам.
Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите программу ПЦР, как указано в текстовой рукописи. Затем проведите реакции при четырех градусах Цельсия. Если исходный шаблон представляет собой плазменную ДНК, добавьте один микролитр фермента рестрикции DpnI, чтобы переварить исходный шаблон и инкубировать реакции при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Проанализируйте пять микролитров каждого продукта ПЦР, разделив их с помощью 1% агарозного геля при 180 вольтах в течение 20 минут. Проверьте правильный размер полосы, который будет варьироваться в зависимости от выбранной последовательности ядра и длины добавленных частей. Очистите линейные шаблоны с помощью коммерческого комплекта для очистки ПЦР.
Если с помощью гелевого электрофореза присутствовало несколько полос, удалите интересующие полосы из геля и очистите ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя. Количественно оцените каждый шаблон ДНК с помощью спектрофотометра, оценив его качество, проверив, что соотношение 260 к 280 нанометрам составляет примерно 1,8. Разморозьте все компоненты на льду и приготовьте мастер-микс, тщательно перемешав все компоненты с пипеткой, как указано в рукописи.
Обратите пристальное внимание, чтобы избежать осаждения, особенно для аминокислотной смеси. Держите мастер-микс на льду. Охладите 384-луночную пластину на льду и распределите мастер-микс девятью микролитровыми аликвотами в каждую лунку.
Разморозьте белок репрессора на льду и распределите его в акустическую пластину источника обработки жидкости, гарантируя, что включено соответствующее количество мертвого объема, необходимого для типа используемой исходной пластины. Распределите белок-репрессор в объемах в один микролитр в соответствующие целевые колодцы через жидкостный обработчик. Включите последовательное разбавление очищенного репортера или соответствующего химического стандарта на пластине для сравнения результатов с другими исследованиями и другими лабораториями.
Выберите диапазон концентраций, соответствующий репортеру, используемому в ожидаемом диапазоне экспрессии экспериментов. Предварительно разогрейте пластинчатый считыватель до 30 градусов Цельсия. Если возможно, на приборе установите вертикальный температурный градиент в один градус Цельсия, чтобы ограничить конденсацию на уплотнении.
Установите считыватель пластин для чтения на настройках, соответствующих репортеру, используемому в основной последовательности, без шагов встряхивания. Запечатайте 384-луночную пластину непроницаемым пластиковым уплотнением для предотвращения испарения. Поместите 384-луночную пластину на держатель пластины и начните чтение.
15 линейных шаблонов, изменяющихся только на расстоянии промотора Т7 относительно последовательности тетО, были подготовлены методом ПЦР, усиливая суперпапку зеленый флуоресцентный белковый репортер, праймерами, предназначенными для добавления каждого варианта промотора. Анализ данных в общей сложности 540 реакций для всего набора комбинаций T7 tetO показал, что РНК-полимераза T7 подавляет экспрессию, вызванную T7, в равной степени, через 13 пар оснований вниз по течению от начала транскрипта T7. Более последовательное дозирование в серии из восьми целевых скважин с использованием акустического обработчика жидкости наблюдалось, когда пятимикролитровая передача была разделена на отдельные одномикролитровые дозы.
Наш протокол может быть использован для быстрого скрининга генетических компонентов, будь то скрининг новых биосенсоров или создание библиотек генетических частей.
