Il nostro metodo consente la rapida caratterizzazione delle parti genetiche utilizzando sistemi di espressione libera da cellule e PCR invece della clonazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ciò che in genere richiede giorni o settimane nelle cellule può essere fatto in ore o giorni usando questo metodo. Il nostro protocollo include passaggi per creare i propri sistemi di espressione privi di cellule, che possono essere complicati in un certo numero di punti e possono richiedere modifiche a seconda del caso d'uso.
Quando inizi per la prima volta, ti consigliamo di iniziare con kit commerciali. Inizia preparando la miscela principale PCR secondo le istruzioni contenute nel manoscritto e conservala su ghiaccio. Aliquot 30 o 40 microlitri del master si mescolano nel numero determinato di provette PCR e aggiungono 10 microlitri di ogni cinque primer variabili micromolari a tubi PCR opportunamente etichettati.
Posizionare i tubi PCR nel termociclatore ed eseguire il programma PCR come indicato nel manoscritto testuale. Quindi, tenere le reazioni a quattro gradi Celsius. Se il modello originale è DNA plasmatico, aggiungere un microlitro di enzima di restrizione DpnI per digerire il modello originale e incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per un'ora.
Analizzare cinque microlitri di ciascun prodotto PCR separandoli utilizzando un gel di agarosio all'1% a 180 volt per 20 minuti. Verificare la dimensione della banda corretta, che varierà in base alla sequenza di nucleo scelta e alla lunghezza delle parti aggiunte. Purificare le dime lineari utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale.
Se fossero presenti più bande mediante elettroforesi su gel, asportare le bande di interesse dal gel e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale, secondo le istruzioni del produttore. Quantificare ogni modello di DNA utilizzando uno spettrofotometro, valutandone la qualità controllando che il rapporto tra 260 e 280 nanometri sia di circa 1,8. Scongelare tutti i componenti sul ghiaccio e preparare un master mix mescolando accuratamente tutti i componenti con una pipetta, come menzionato nel manoscritto.
Prestare molta attenzione per evitare precipitazioni, soprattutto per la miscela di aminoacidi. Mantenere il master mix sul ghiaccio. Raffreddare una piastra da 384 pozzetti sul ghiaccio e distribuire la miscela principale in aliquote da nove microlitri in ciascun pozzetto.
Scongelare la proteina repressore sul ghiaccio e distribuirla in una piastra sorgente acustica per la manipolazione del liquido, assicurandosi che sia inclusa la quantità appropriata di volume morto richiesta per il tipo di piastra sorgente utilizzata. Distribuire la proteina repressore in volumi da un microlitro nei pozzetti di destinazione appropriati tramite il gestore di liquidi. Includere una diluizione seriale del reporter purificato o uno standard chimico appropriato sulla piastra per confrontare i risultati con altri studi e altri laboratori.
Scegliere un intervallo di concentrazioni appropriato per il reporter utilizzato nell'intervallo di espressione previsto degli esperimenti. Preriscaldare il lettore di piastre a 30 gradi Celsius. Se possibile, sullo strumento, impostare un gradiente di temperatura verticale di un grado Celsius per limitare la condensa sulla guarnizione.
Impostare il lettore di lastre in modo che legga alle impostazioni appropriate per il reporter utilizzato nella sequenza principale, senza oscillare i passaggi. Sigillare la piastra a 384 pozzetti con una guarnizione in plastica impermeabile per evitare l'evaporazione. Posizionare la piastra a 384 pozzetti sul supporto della piastra e iniziare a leggere.
15 modelli lineari, variabili solo nella distanza del promotore T7 rispetto alla sequenza tetO, sono stati preparati mediante PCR, amplificando il reporter di proteine fluorescenti verdi della supercartella, con primer progettati per aggiungere ogni variante del promotore. L'analisi dei dati di un totale di 540 reazioni per l'intero set di combinazioni T7 tetO ha mostrato che la T7 RNA polimerasi downregola l'espressione guidata da T7 allo stesso modo, fino a 13 coppie di basi a valle dall'inizio del trascritto T7. Un'erogazione più coerente attraverso la serie di otto pozzi di destinazione utilizzando il gestore di liquidi acustico è stata osservata quando un trasferimento di cinque microlitri è stato diviso in erogazioni separate da un microlitro.
Il nostro protocollo può essere utilizzato per lo screening rapido dei componenti genetici, sia per lo screening di nuovi biosensori che per la costruzione di librerie di parti genetiche.
