הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

אנגיוגנזה לשחק תפקיד חשוב גרורות הגידול והתקדמות. בפרוטוקול זה, נשתמש בשיטת הדמיה ביולומינציה כפולה כדי לפקח על התקדמות הגידול הדינמי ואנגיוגנזה במודל עכבר של סרטן השד. במודל זה, אנו יכולים לעקוב אחר הגידול ואנגיוגנזה בו זמנית בעכבר יחיד דרך Firefly luciferase ורניה לוציפראז הדמיה, בהתאמה.

מודל זה עשוי להיות מיושם באופן נרחב בהקרנת תרופות antitumor ומחקר אונקולוגי. מודל ביולומינציה כפול זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול רגרסיה ולזהות תהליכים מולקולריים הקשורים לגידול בתגובה לאסטרטגיות טיפוליות. אנגיוגנזה היא תהליך מכריע של התקדמות הגידול.

לכן, ניטור התקדמות הגידול ואנגיוגנזה באופן חזותי ורגיש יש צורך בפיתוח טיפולים יעילים בגידול. ההליכים יוכחו על ידי קאיו זאנג, צ'ן וונג ושאנג צ'ן, סטודנטים מהמעבדה שלנו. לאריזת lentivirus וזרעי ייצור פעם אחת 10 עד השישית של 293T תאים בשני מיליליטר של DMEM בתוספת 10% סרום לב עוברי לתוך צלחת שש באר לתרבות לילה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר לערבב 7.5 microliters של ליפוזום עם 250 microliters של מדיום חיוני מינימלי בשני צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי להכין את פתרונות ה-DNA להוסיף את וקטור RR lentivirus פלסמיד ופלסמיד עוזר 250 microliters של מדיום חיוני מינימלי צינורות בודדים 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה. בסוף הדגירה מוסיפים בעדינות את פתרונות ה- DNA RR להשעיות ליפוזום בצורה רכה ומאפשרים לדנ"א להתחבר למברנות השומנים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

בעוד התערובת היא דגירה, להחליף את supernatant של תרבות התא 293T עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי, בעדינות להוסיף 0.5 מיליליטר של תערובת DNA ליפוזום המתאים לכל באר. מחזירים את התאים לחממת תרבות התאים למשך 12 עד 16 שעות לפני החלפת העל-טבעי בכל באר במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר 36 שעות נוספות של דגירה, בריכת supernatants לתוך צינור חרוט אחד לכל זן lentivirus כדי להכביד על התאים 293T על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן העבר את lentivirus RR המכיל עלנטנטים לתוך צינורות אחסון פוליפרופילן סטריליים בודדים 1.5 מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור lentiviral transduction עבור ביטוי גנים בתאי גידול 4T1 mammary, להחליף את supernatant בכל באר של שישה בארות 4T1 צלחת תרבות התא עם מיליליטר אחד של טרי RPMI מבוססי תאים בינוני בתוספת סרום לב העובר אחד מיליליטר של מלאי lentiviral. לאחר מכן מוסיפים שמונה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברין לכל באר, ובעדינות פיפטה כמה פעמים כדי לערבב.

צנטריפוגה הצלחת כדי לעזור להגדיל את יעילות ההתמרה, ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך ארבע עד 12 שעות. בסוף הדגירה, להחליף את supernatant בכל באר עם בינוני תרבות טרי בתוספת סרום ואנטיביוטיקה כדי להסיר את כל החלקיקים lentiviral ו Polybrene. כדי לבחור עבור התאים שתומרו על-ידי lentivirus, מעבר בין תרבות התאים המומרים של 4T1 ביחס של אחד לשלוש עד אחד עד ארבעה עם מדיום הבחירה, ומשנה את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.

לאחר שבעה ימים של בחירה בתרבות בינונית, הצג את תרבות התאים המתומרות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך פלואורסצנטי וספירת מספר תאי החלבון הפלורסנט האדומים החיוביים או RFP-4T1 ואת כל תאי ה- 4T1 בשלושה תחומי ראייה כדי להעריך את היחס החיובי RFP. כדי להקים מודל עכבר נושא גידול, לשטוף תרבות תאים מתמרים 80%confluent עם PBS לפני ניתוק התאים עם שני מיליליטר של טריפסין-EDTA לכל צלחת תרבות 60 מילימטר. כאשר התאים הרימו מהתחתית צלחת לעצור את התגובה עם חמישה עד 10 מיליליטר של סרום בתוספת בינוני לכל צלחת.

ולהעביר את התרבויות לצינורות צנטריפוגה בודדים של 15 מיליליטר לספירה. מדללים את התאים לתאים פי 10 עד השישי לכל 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי ללא ריכוז סרום. ובאופן תת עורי להזריק 100 microliters של קו התא 4T1-RR לתוך הכתף השמאלית של עכבר מודל נושא גידול הרדמה, ו 100 microliters של קו התא 4T1-RRT לתוך הכתף הימנית של אותו עכבר.

לאחר הזריקות, מניחים כל עכבר באזור התאוששות מתאים עם תמיכה תרמית עד להחלמה מלאה. יש למפות את גושי הגידול כל יום במשך שבעה ימים כדי לאשר שהעכברים נושאים גידולים. ביום שבע לאחר ההשתלה, להזריק תוך-אפית 50 מיקרוגרם לקילוגרם של Ganciclovir לתוך כל עכבר נושא גידול פעמיים ביום עד סוף הניסוי.

לגידול הגידול, פתחו את מערכת ההדמיה החיה. אתחל את תוכנת ההדמיה החיה ואתחל את המערכת. בזמן שהמערכת מאתחלת, השתמש במזרק אינסולין כדי להזריק כל עכבר כדי לדמיין אותו עם הנפח המתאים של קולנטראזין לתוך הרטרובולבר.

מניחים את העכברים מוזרק לתוך תא המצלמה מיד להשיג כמה תמונות של העכבר dorsally לרכוש את אותות רנילה לוציפראז מתאי 4T1 עד אותות bioluminescent לדעוך. 10 דקות לאחר הדמיה רנילה לוציפראז, להשתמש מזרק אינסולין להזריק תוך-אפית את הנפח המתאים של D-luciferin לתוך כל חיה. 10 דקות לאחר הזרקת D-luciferin, למקם את העכברים לתוך תא המצלמה ולקבל כמה תמונות של הגב העכבר לרכוש את אותות לוציפראז פיירפלי מאנגיוגנזה.

לאחר ההתמרה lentivirus, יותר מ 99% מהתאים הם RFP חיובי ללא הבדלים מורפולוגיה של תאים שנצפו בין שני קווי התאים מתומרים. לאחר מכן, דימות ביולומינציה של התאים המתומרים מגלה כי שני קווי התא פולטים אותות ביולומינסנטיים חזקים בעוצמה דומה. לאחר הזרקה תת עורית של קווי התאים המתומרים למודל עכבר נושא גידול מהומר, צמיחת גידול הנגרמת על ידי אנגיוגנזה ניתן להעריך על ידי אותות לוציפראז פיירפלי בנוכחות D-לוסיפרין באותה חיה.

בשבעה ימים לאחר ההשתלה, ממשל Ganciclovir גורם למוות בתאי 4T1-RRT וכתוצאה מכך ירידה דרמטית באותות רנה לוציפראז בגידולים שנקבעו על ידי תאים אלה. אותות לוציפראז גחלילית גם להגדיל בשילוב עם עלייה בביטוי רנילה לוציפראז וירידה בעקבות ירידה לוציפראז. יחד, תוצאות אלה מראות כי יש מתאם ישיר בין אנגיוגנזה הגידול וצמיחה הגידול.

אכן, מוות תאי הגידול הנגרמת על ידי Ganciclovir עלול להוביל לעיכוב של אנגיוגנזה הגידול. כמו כן, immunostaining עבור קולטן גורם גדילה אנדותל נגד כלי דם II, כסמן של אנגיוגנזה, חושף מבנה מיקרו-וסקולרי מבוסס יותר באופן משמעותי בסעיפים רקמת גידול 4T1-RR מאשר בחלקים מגידולים 4T1-RRT, עולה בקנה אחד עם הירידה בסימן Luciferase פיירפלי נצפתה לאחר ממשל Ganciclovir. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא שימוש בשני סוגים של לוציפראז, כגון FLuc ו- RLuc למעקב בו זמנית של התאים והאנגיוגנזה.

טכנולוגיה זו יכולה לשמש לטיפול בתאים סרטניים במקומות שונים, וזה יכול לשמש נרחב במודלים סרטן וירוס. מודל העכבר הזה מאפשר לצמיחת הגידול ואת ההשפעות האנטי-סרטניות של מערכת המעקב HSV-ttk/GCV להיות חזותי באופן דינמי בבעל חיים חי. מתקן ביוספטי ברמה II נדרש כדי למנוע transfection lentivirus, כמו התקשורת מכילה חלקיקי lentivirus שעלולים להזיק לבני אדם.