פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, הטיפוח והזיהוי של מיקרואורגניזמים מפרקים פחמימנים מבתי גידול אקולוגיים. שיטה זו אינה דורשת מכשירים מתוחכמים, וניתן לבצע אותה בקלות במערך מעבדה סטנדרטי. זה יכול גם להיות מותאם בקלות ללמוד מצעים אחרים.
טכניקה זו יכולה בקלות להיות מתורגמת לנישות אקולוגיות שונות, ואת השפלה של מצעים שונים ניתן להעריך. מי שתדגים את ההליך תהיה דיפא סת'י, דוקטורנטית מהמעבדה של ד"ר ריצ'ה פריאדארשיני. כדי להתחיל, אספו 500 מיליליטר דגימת מים בחמישה בקבוקי זכוכית סטריליים מאתרי גוף מים שונים, ומדדו את רמת החומציות והטמפרטורה של כל דגימה.
לאחר מכן סנן את הדגימה בתנאים אספטיים בקבוצות של 100 מיליליטר דרך יריעות מסנן בגודל נקבוביות 0.22 מיקרון. והניחו את הדפים על לוחות מדיה תזונתיים שונים, והניחו נייר אחד בכל צלחת. לאחר שעתיים, מקלפים את הנייר באמצעות מלקחיים סטריליים.
לאחר מכן, לדלל את דגימות המים הלא מסוננים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של דגימת המים שנאספו ל 900 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים סטריליים. המשך את דילולים פי עשרה עד יחס דילול של אחד ל 1, 000, 000 הוא הגיע. מערבבים על ידי פיפטינג, ומוודאים שהנפח הסופי של כל דילול הוא מיליליטר אחד.
פזרו 100 מיקרוליטר של דגימות המים המדוללות בנפרד על כל לוחות מצעי הגידול, בטריפליקטים. לדגור את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות, בהתאם לצמיחה של מושבות. כדי לקבל מושבות מבודדות, בחר מושבה באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה.
בצעו ריצוף רבעי, ודגרו על הצלחת למשך הלילה. למחרת, סנן את המושבות על פי תכונותיהן המורפולוגיות, כגון צבע, מרקם, צורה, גודל, שוליים וגובה. פזרו מחדש את המושבות כדי להשיג תרבויות טהורות.
לאחר ביצוע צביעת גרם של כל תרבית טהורה, מכינים מלאי גליצרול על ידי חיסון מושבה אחת בשלושה מיליליטר של מצע גידול מתאים, ודגרה ב -30 מעלות צלזיוס. למחרת, הוסיפו 700 מיקרוליטר של תרבית הלילה, ו-300 מיקרוליטר של 100% גליצרול בבקבוקוני קריו. הקפיאו את הבקבוקונים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
מתוך צלחת פסים טריים, לבחור מושבה ולחסן אותו חמישה מיליליטר של מרק סויה טריפטי או מרק מזין. מגדילים את התרבית לילה ב-30 מעלות צלזיוס, עם רעידות ב-200 סל"ד, עד שהספיגה מגיעה לכשתיים. למחרת, גלולה את התאים.
להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה פעמיים עם שני מיליליטר של מלוחים autoclaved. סובבו שוב את התאים, ואז השהו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום בסיסי נוזלי נטול פחמן, או LCFBM, ומדדו את הספיגה. לאחר מכן, תייגו שתי צלוחיות Erlenmeyer סטריליות של 150 מיליליטר כ-A ו-B, עבור קבוצת הבקרה והניסוי בהתאמה.
בבקבוק A, מוסיפים 40 מיליליטר של LCFBM, ואחריו סטירן בריכוז סופי של חמישה מילימולרי. בבקבוק B, מוסיפים 35 מיליליטר של LCFBM וסטירן. לאחר מכן להוסיף את השעיית התא עם ספיגה סופית של כ 0.1.
לאחר העלאת נפח בקבוק B ל 40 מיליליטר עם LCFBM, לדגור על שתי הצלוחיות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד ב 200 סל"ד במשך 30 ימים. מדדו את הספיגה של כל בקבוק כל חמישה ימים, והתוו עקומת גדילה. הגדילו את הדגירה עד 45 יום אם החיידקים יכולים להשתמש בסטירן.
עלייה בספיגה מצביעה על כך שהחיידק יכול לעכל סטירן. כדי לבודד דנ"א גנומי מחיידקים גראם-שליליים, בחרו מושבה בודדת וחסנו אותה במצע גידול טרי במבחנה סטרילית. לאחר דגירה של לילה באינקובטור מטלטל, גלולה 1.5 מיליליטר של התרבות הגדלה.
הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 200 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. לאחר מכן מוסיפים 66 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי חמש טוחנות, ומערבבים היטב. לאחר צנטריפוגה של התערובת המתקבלת, פיפטה את שקוף supinate בצינור מיקרו צנטריפוגה טרי, ולהוסיף נפח שווה של כלורופורם.
מערבבים את התמיסה על ידי היפוכה מספר פעמים, עד שנצפתה תמיסה חלבית. סובבו שוב את הצינור, והעבירו את הסופרנאטנט לבקבוקון נקי. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של אתנול קר כקרח, ולערבב על ידי היפוך, עד גדילי DNA לבנים לזרז החוצה.
צנטריפוגה את הדנ"א המואץ. השליכו את הסופרנטנט. ולשטוף את הגלולה עם מיליליטר אחד של 70% אתנול.
לאחר השלכת השטיפה, הניחו לגלולת הדנ"א להתייבש במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש, להשהות מחדש את הגלולה ב 100 מיקרוליטר של חיץ Tris-EDTA. למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר, ולהריץ את הדנ"א על ג'ל אגרוז 1% כדי להעריך את איכותו.
כדי לזהות את הזנים, הגבירו את הדנ"א שבודד מתרביות החיידקים הטהורים על ידי PCR, עם פריימרים אוניברסליים המכוונים לרצף הרנ"א הריבוזומלי 16S עבור חיידקים. הכינו 25 מיקרוליטר של תערובת ה-PCR על קרח, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תבנית הדנ"א והגדירו את תנאי המחזור להגברה גנטית. לאחר PCR, לערבב חמישה מיקרוליטר של הדגימה עם מיקרוליטר אחד של חמש פעמים צבע טעינת DNA.
ולהפעיל אותו על ג'ל אגרוז 1% כדי לאמת את ההגברה. עבור ריצוף גן ריבוזומלי מסוג 16S, rNA, יוצר את אותה תגובה כפי שתוארה קודם לכן, אך בנפח גבוה יותר. לאחר מכן, כדי לטהר את האמפליקונים לריצוף סנגר, ערבבו את הדגימה כולה עם צבע טעינת DNA, והעמיסו אותה על ג'ל אגרוז לביצוע שיטת מיצוי הג'ל.
לאחר השלמת הרצף, המר את קובץ התוצאות לפורמט מהיר יותר, ובדוק את דמיון הרצף באמצעות הכלי BLAST ב- NCBI. מושבות חיידקים שבודדו מדגימות מים מביצות בדדרי, הודו מוצגות כאן. החיידקים המבודדים גודלו בנפרד במדיה המתאימה, עם סטירן נוזלי כמקור יחיד לפחמן.
פוטנציאל פירוק הפחמימנים של מבודדי החיידקים הוערך באמצעות בדיקת פירוק קטכול. בדיקה מייצגת של אחד המבודדים מוצגת כאן. שלמות הדנ"א הגנומי אושרה על ידי הדמיה של דגימת DNA קטנה על ג'ל אגרוז.
והגן 16S ribosomal rNA הוגבר באמצעות פריימרים אוניברסליים. עץ פילוגנטי נבנה כדי לתאר את הקרבה בין זני exiguobacterium שבודדו מאזור ביצות, עם המין הידוע exiguobacterium. שלב קריטי בפרוטוקול הוא בדיקת ניצול המצע הנבדק.
בהתאם למאפייני הגדילה, ייתכן שהחיידק לא יסתגל באופן מיידי לניצול המצע הנבדק, ועשוי לדרוש תהליך העשרה. שיטה זו מתמקדת באוכלוסיית החיידקים הניתנת לגידול בדגימות סביבתיות. חוקרים יכולים להמשיך ולבצע ניסויים, כגון ריצוף גנום שלם של חיידקים ופרופיל מטבולי, שיכולים לספק תובנות יקרות ערך לגבי גנים ומסלולים המעורבים בפירוק פחמימנים.
