Bu protokol, ekolojik habitatlardan hidrokarbon bozunan mikroorganizmaların izolasyonunu, yetiştirilmesini ve tanımlanmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu yöntem sofistike aletler gerektirmez ve standart bir laboratuvar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir. Diğer alt tabakaları incelemek için de kolayca uyarlanabilir.
Bu teknik, çeşitli ekolojik nişlere kolayca çevrilebilir ve farklı substratların bozulması değerlendirilebilir. Prosedürü göstermek, Dr.Richa Priyadarshini'nin laboratuvarından doktora öğrencisi olan Deepa Sethi olacak. Başlamak için, farklı su kütlesi bölgelerinden beş steril cam şişede 500 mililitre su numunesi toplayın ve her numunenin pH'ını ve sıcaklığını ölçün.
Daha sonra numuneyi aseptik koşullar altında 100 mililitrelik gruplar halinde 0,22 mikron gözenek boyutundaki filtre tabakaları aracılığıyla filtreleyin. Ve yaprakları, her tabağa bir kağıt yerleştirerek farklı besleyici ortam plakalarının üzerine yerleştirin. İki saat sonra, steril forseps kullanarak kağıdı soyun.
Daha sonra, toplanan su örneğinden 100 mikrolitre steril çift damıtılmış suya 900 mikrolitre ekleyerek filtrelenmemiş su örneklerini seyreltin. Bir ila 1.000.000 seyreltme oranına ulaşılana kadar on kat seyreltmeye devam edin. Pipetleme ile karıştırın ve her seyreltmenin son hacminin bir mililitre olduğundan emin olun.
100 mikrolitre seyreltilmiş su örneğini tüm büyüme ortamı plakalarına ayrı ayrı, üçlü olarak yayın. Kolonilerin büyümesine bağlı olarak plakaları 30 santigrat derecede 24 ila 48 saat inkübe edin. İzole koloniler elde etmek için steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak bir koloni seçin.
Kadran çizgileme yapın ve plakayı gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kolonileri renk, doku, şekil, boyut, kenar boşluğu ve yükseklik gibi morfolojik özelliklerine göre tarayın. Saf kültürler elde etmek için kolonileri yeniden çizin.
Her saf kültürün gram boyamasını gerçekleştirdikten sonra, tek bir koloniyi üç mililitre uygun büyüme ortamına aşılayarak ve 30 santigrat derecede inkübe ederek gliserol stokları hazırlayın. Ertesi gün, kriyo şişelerine 700 mikrolitre gece kültürü ve 300 mikrolitre% 100 gliserol ekleyin. Uzun süreli saklama için şişeleri eksi 80 santigrat derecede dondurun.
Taze çizgili bir tabaktan bir koloni seçin ve beş mililitre triptik soya suyu veya besin suyuna aşılayın. Kültürü gece boyunca 30 santigrat derecede, 200 RPM'de çalkalayarak, absorbans yaklaşık ikiye ulaşana kadar büyütün. Ertesi gün, hücreleri peletleyin.
Süpernatanı atın ve peleti iki mililitre otoklavlanmış salinle iki kez yıkayın. Hücreleri tekrar döndürün, ardından peleti iki mililitre sıvı karbonsuz bazal ortamda veya LCFBM'de yeniden süspanse edin ve emilimi ölçün. Daha sonra, kontrol ve deney grubu için iki steril 150 mililitre Erlenmeyer şişesini sırasıyla A ve B olarak etiketleyin.
A şişesine 40 mililitre LCFBM ekleyin, ardından beş milimolar son konsantrasyonda bir stiren ekleyin. B şişesine 35 mililitre LCFBM ve stiren ekleyin. Ardından, yaklaşık 0.1'lik bir son absorbansa sahip hücre süspansiyonunu ekleyin.
B şişesindeki hacmi LCFBM ile 40 mililitreye çıkardıktan sonra, her iki şişeyi de 30 gün boyunca 200 RPM'de çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Her bir şişenin emilimini her beş günde bir ölçün ve bir büyüme eğrisi çizin. Bakteriler stiren kullanabiliyorsa inkübasyonu 45 güne kadar artırın.
Absorbanstaki bir artış, bakterinin stireni metabolize edebileceğini gösterir. Genomik DNA'yı gram negatif bakterilerden izole etmek için, tek bir koloni seçin ve steril bir test tüpünde taze bir büyüme ortamına aşılayın. Çalkalanan bir inkübatörde gece boyunca inkübattan sonra, yetiştirilen kültürün 1.5 mililitresini peletleyin.
Süpernatanı çıkarın ve peleti 200 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra 66 mikrolitre beş molar sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Elde edilen karışımı santrifüjledikten sonra, berrak supinatı taze bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve eşit hacimde kloroform ekleyin.
Çözeltiyi, sütlü bir çözelti görülene kadar birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü tekrar döndürün ve süpernatanı temiz bir şişeye aktarın. Daha sonra, bir mililitre buz gibi% 100 etanol ekleyin ve beyaz DNA zincirleri çökelinceye kadar ters çevirerek karıştırın.
Çökeltilmiş DNA'yı santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Ve peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın.
Yıkamayı attıktan sonra, DNA peletinin oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, peleti 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda tekrar süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün ve kalitesini değerlendirmek için DNA'yı %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.
Suşları tanımlamak için, saf bakteri kültürlerinden izole edilen DNA'yı, bakteriler için 16S ribozomal RNA dizisini hedefleyen evrensel primerlerle PCR ile çoğaltın. Buz üzerinde 25 mikrolitre PCR karışımı hazırlayın, bir mikrolitre DNA şablonu ekleyin ve gen amplifikasyonu için döngü koşullarını ayarlayın. PCR'den sonra, numunenin beş mikrolitresini bir mikrolitre beş kez DNA yükleme boyası ile karıştırın.
Ve amplifikasyonu doğrulamak için% 1 agaroz jel üzerinde çalıştırın. 16S ribozomal için, rNA gen dizilimi, daha önce tarif edilenle aynı reaksiyonu ayarlayın, ancak daha yüksek bir hacimde. Daha sonra, Sanger dizilimi için amplikonları saflaştırmak için, tüm numuneyi DNA yükleme boyası ile karıştırın ve jel ekstraksiyon yöntemini gerçekleştirmek için bir agaroz jel üzerine yükleyin.
Sıralama tamamlandıktan sonra, sonuç dosyasını daha hızlı bir biçime dönüştürün ve NCBI'deki BLAST aracını kullanarak dizi benzerliğini kontrol edin. Hindistan'ın Dadri kentindeki bir sulak alandan alınan su örneklerinden izole edilen bakteri kolonileri burada gösterilmektedir. İzole edilen bakteriler, tek karbon kaynağı olarak sıvı stiren ile ilgili ortamda ayrı ayrı büyütüldü.
Bakteriyel izolatların hidrokarbon bozunma potansiyeli, bir katekol bozunma deneyi kullanılarak değerlendirildi. İzolatlardan biri için temsili bir tahlil burada gösterilmektedir. Genomik DNA'nın bütünlüğü, bir agaroz jeli üzerinde küçük bir DNA örneği görselleştirilerek doğrulandı.
Ve 16S ribozomal rNA geni, evrensel primerler kullanılarak amplifiye edildi. Bir sulak alandan izole edilen exiguobacterium suşları ile bilinen exiguobacterium türleri arasındaki ilişkiyi göstermek için filogenetik bir ağaç inşa edildi. Protokolün kritik bir adımı, test edilen alt tabakanın kullanımını kontrol etmektir.
Büyüme özelliklerine bağlı olarak, mikrop test edilen substratın kullanımına hemen uyum sağlamayabilir ve bir zenginleştirme işlemi gerektirebilir. Bu yöntem, çevresel örneklerde ekilebilir bakteri popülasyonuna odaklanır. Araştırmacılar ayrıca, hidrokarbon bozunmasında rol oynayan genler ve yollar hakkında değerli bilgiler sağlayabilecek bakteriyel tüm genom dizilimi ve metabolik profilleme gibi deneyler yapabilirler.
