В этом протоколе описывается выделение, культивирование и идентификация микроорганизмов, разлагающих углеводороды, из экологических местообитаний. Этот метод не требует сложных инструментов и может быть легко выполнен в стандартной лабораторной установке. Он также может быть легко адаптирован для изучения других субстратов.
Эта методика может быть легко перенесена на различные экологические ниши, и можно оценить деградацию различных субстратов. Демонстрацию процедуры проведет Дипа Сети, докторант из лаборатории доктора Ричи Приядаршини. Для начала соберите 500 миллилитров пробы воды в пять стерильных стеклянных бутылок из разных водоемов и измерьте pH и температуру каждого образца.
Затем отфильтруют пробу в асептических условиях партиями по 100 миллилитров через фильтрующие листы с размером пор 0,22 мкм. И поместите листы на разные пластины с питательными средами, положив по одной бумаге на тарелку. Через два часа отклейте бумагу с помощью стерильных щипцов.
Затем разбавьте нефильтрованную пробу воды, добавив 100 микролитров собранной пробы воды к 900 микролитрам стерильной воды двойной дистиллированной воды. Продолжайте десятикратное разведение до тех пор, пока не будет достигнуто соотношение разбавления 1 к 1 000 000. Перемешайте пипеткой и убедитесь, что окончательный объем каждого разведения составляет один миллилитр.
Распределите 100 микролитров разбавленных проб воды по отдельности на все планшеты с питательными средами, в три раза. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия от 24 до 48 часов, в зависимости от роста колоний. Чтобы получить изолированные колонии, выберите колонию с помощью стерильной зубочистки или наконечника пипетки.
Выполните полосы квадранта и инкубируйте пластину в течение ночи. На следующий день проведите скрининг колоний на основе их морфологических особенностей, таких как цвет, текстура, форма, размер, край и высота. Повторно протригируйте колонии, чтобы получить чистые культуры.
После окрашивания каждой чистой культуры по Граму подготавливают запасы глицерина, засеивая одну колонию в три миллилитра соответствующей питательной среды и инкубируя при 30 градусах Цельсия. На следующий день добавьте 700 микролитров ночной культуры и 300 микролитров 100%-ного глицерина в криофлаконы. Заморозьте флаконы при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения.
Из только что покрытой прожилками тарелки соберите колонию и инокулируйте ее в пять миллилитров трехплодного соевого бульона или питательного бульона. Выращивайте культуру в течение ночи при температуре 30 градусов по Цельсию, встряхивая при 200 оборотах в минуту, пока поглощение не достигнет примерно двух. На следующий день гранулируйте клетки.
Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте гранулы двумя миллилитрами автоклавного солевого раствора. Снова вращайте ячейки, затем снова суспендируйте гранулу в двух миллилитрах жидкой безуглеродной базальной среды, или LCFBM, и измерьте поглощение. Затем обозначьте две стерильные 150-миллилитровые колбы Эрленмейера как A и B, для контрольной и экспериментальной групп соответственно.
В колбу А добавьте 40 миллилитров LCFBM, а затем стирол с конечной концентрацией пять миллимоляров. В колбу Б добавьте по 35 миллилитров LCFBM и стирола. Затем добавьте клеточную суспензию с конечной абсорбцией примерно 0,1.
Доведя объем в колбе Б до 40 миллилитров с помощью LCFBM, инкубируйте обе колбы при температуре 30 градусов Цельсия при встряхивании при 200 об/мин в течение 30 дней. Измеряйте впитываемость каждой колбы каждые пять дней и стройте кривую роста. Увеличьте инкубацию до 45 дней, если бактерии могут использовать стирол.
Увеличение абсорбции указывает на то, что бактерия может метаболизировать стирол. Чтобы выделить геномную ДНК из грамотрицательных бактерий, выберите одну колонию и засейте ее в свежую питательную среду в стерильную пробирку. После ночной инкубации во встряхивающем инкубаторе гранулируют 1,5 миллилитра выращенной культуры.
Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах лизисного буфера. Затем добавьте 66 микролитров пятимолярного раствора натрия хлорида и хорошо перемешайте. После центрифугирования полученной смеси пипетку прозрачного супината помещают в свежую микроцентрифужную пробирку и добавляют равный объем хлороформа.
Перемешайте раствор, перевернув его несколько раз, пока не появится молочный раствор. Снова прокрутите тюбик и перелейте надосадочную жидкость в чистый флакон. Затем добавьте один миллилитр ледяного 100% этанола и перемешайте методом инверсии, пока белые нити ДНК не выпадут в осадок.
Центрифугируют осажденную ДНК. Выбросьте надосадочную жидкость. И промыть гранулу одним миллилитром 70%-ного этилового спирта.
После отмывки дайте грануле ДНК высохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре. После сушки повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера Tris-EDTA. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и запустите ДНК на 1%-ном агарозном геле, чтобы оценить ее качество.
Для идентификации штаммов амплифицируют ДНК, выделенную из чистых бактериальных культур, методом ПЦР с помощью универсальных праймеров, нацеленных на последовательность 16S рибосомной РНК бактерий. Приготовьте 25 микролитров ПЦР-смеси на льду, добавьте один микролитр матрицы ДНК и установите циклические условия для амплификации генов. После ПЦР смешайте пять микролитров образца с одним микролитром красителя, в пять раз загружающего ДНК.
И запустите его на 1%-ном агарозном геле, чтобы проверить амплификацию. Для секвенирования гена 16S рибосомы рНК необходимо провести ту же реакцию, что описано ранее, но в большем объеме. Затем, чтобы очистить ампликоны для секвенирования по Сэнгеру, весь образец смешают с красителем, загружающим ДНК, и загружают его в агарозный гель для выполнения метода гелевой экстракции.
После завершения секвенирования преобразуйте файл результатов в более быстрый формат и проверьте сходство последовательностей с помощью инструмента BLAST на NCBI. Здесь показаны колонии бактерий, выделенные из проб воды из водно-болотных угодий в Дадри, Индия. Изолированные бактерии были индивидуально выращены в соответствующих средах, с жидким стиролом в качестве единственного источника углерода.
Углеводородоразлагающий потенциал бактериальных изолятов оценивали с помощью анализа разложения катехинов. Репрезентативный анализ одного из изолятов показан здесь. Целостность геномной ДНК была подтверждена визуализацией небольшого образца ДНК на агарозном геле.
А ген 16S рибосомной рНК амплифицировали с помощью универсальных праймеров. Филогенетическое дерево было построено, чтобы изобразить родство между штаммами exiguobacterium, выделенными из водно-болотных угодий, с известными видами exiguobacterium. Важнейшим этапом протокола является проверка использования тестируемого субстрата.
В зависимости от характеристик роста, микроб может не сразу адаптироваться к использованию тестируемого субстрата и может потребовать процесса обогащения. Этот метод фокусируется на культивируемой популяции бактерий в образцах окружающей среды. Исследователи могут проводить дальнейшие эксперименты, такие как секвенирование всего генома бактерий и метаболическое профилирование, которые могут дать ценную информацию о генах и путях, участвующих в разложении углеводородов.
