Este protocolo describe el aislamiento, cultivo e identificación de microorganismos degradadores de hidrocarburos de hábitats ecológicos. Este método no requiere instrumentos sofisticados y se puede realizar fácilmente en una configuración de laboratorio estándar. También se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sustratos.
Esta técnica se puede trasladar fácilmente a varios nichos ecológicos, y se puede evaluar la degradación de diferentes sustratos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Deepa Sethi, estudiante de doctorado del laboratorio del Dr. Richa Priyadarshini. Para comenzar, recoja 500 mililitros de muestra de agua en cinco botellas de vidrio estériles de diferentes sitios del cuerpo de agua y mida el pH y la temperatura de cada muestra.
A continuación, filtre la muestra en condiciones asépticas en lotes de 100 mililitros a través de láminas de filtro de tamaño de poro de 0,22 micras. Y coloque las hojas sobre diferentes platos de medios nutritivos, colocando un papel por plato. Después de dos horas, retire el papel con pinzas estériles.
A continuación, diluya las muestras de agua sin filtrar añadiendo 100 microlitros de la muestra de agua recogida a 900 microlitros de agua estéril de doble destilación. Continúe las diluciones diez veces hasta alcanzar una relación de dilución de uno a 1, 000, 000. Mezclar por pipeteo y asegurarse de que el volumen final de cada dilución sea de un mililitro.
Esparcir 100 microlitros de las muestras de agua diluida individualmente en todas las placas de sustrato, por triplicado. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 24 a 48 horas, dependiendo del crecimiento de las colonias. Para obtener colonias aisladas, elija una colonia con un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta.
Realice el rayado de cuadrante e incube la placa durante la noche. Al día siguiente, examine las colonias en función de sus características morfológicas, como el color, la textura, la forma, el tamaño, el margen y la elevación. Volver a escorar las colonias para obtener cultivos puros.
Después de realizar la tinción de Gram de cada cultivo puro, prepare las reservas de glicerol inoculando una sola colonia en tres mililitros de medio de crecimiento apropiado e incubando a 30 grados centígrados. Al día siguiente, agregue 700 microlitros del cultivo durante la noche y 300 microlitros de glicerol al 100% en viales criogénicos. Congele los viales a menos 80 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.
De un plato recién rayado, elija una colonia y inocule en cinco mililitros de caldo de soja tríptico o caldo nutritivo. Cultive el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados, con agitación a 200 RPM, hasta que la absorbancia alcance aproximadamente dos. Al día siguiente, granule las células.
Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces con dos mililitros de solución salina esterilizada en autoclave. Vuelva a girar las celdas, luego vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de medio basal líquido libre de carbono, o LCFBM, y mida la absorbancia. A continuación, etiquete dos matraces estériles de 150 mililitros de Erlenmeyer como A y B, para el grupo control y experimental, respectivamente.
En el matraz A, añadir 40 mililitros de LCFBM, seguido de un estireno a una concentración final de cinco milimolares. En el matraz B, añadir 35 mililitros de LCFBM y estireno. A continuación, añada la suspensión celular con una absorbancia final de aproximadamente 0,1.
Después de aumentar el volumen en el matraz B a 40 mililitros con LCFBM, incubar ambos matraces a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM durante 30 días. Mida la absorbancia de cada matraz cada cinco días y trace una curva de crecimiento. Aumente la incubación hasta 45 días si las bacterias pueden utilizar estireno.
Un aumento en la absorbancia indica que la bacteria puede metabolizar el estireno. Para aislar el ADN genómico de las bacterias gramnegativas, elija una sola colonia e inocule en un medio de cultivo fresco en un tubo de ensayo estéril. Después de la incubación durante la noche en una incubadora agitadora, pellet 1,5 mililitros del cultivo cultivado.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 200 microlitros de tampón de lisis. Luego agregue 66 microlitros de solución de cloruro de sodio de cinco molares y mezcle bien. Después de centrifugar la mezcla resultante, pipetear el supinato transparente en un tubo de microcentrífuga nuevo y agregar un volumen igual de cloroformo.
Mezcle la solución invirtiéndola varias veces, hasta que se observe una solución lechosa. Vuelva a girar el tubo y transfiera el sobrenadante a un vial limpio. A continuación, agregue un mililitro de etanol 100% helado y mezcle por inversión, hasta que se precipiten hebras blancas de ADN.
Centrifugar el ADN precipitado. Deseche el sobrenadante. Y lavar el pellet con un mililitro de etanol al 70%.
Después de desechar el lavado, deje que el gránulo de ADN se seque durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez seco, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de tampón Tris-EDTA. Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro y ejecute el ADN en un gel de agarosa al 1% para evaluar su calidad.
Para identificar las cepas, amplifique el ADN aislado de los cultivos bacterianos puros mediante PCR, con cebadores universales dirigidos a la secuencia de ARN ribosómico 16S para bacterias. Prepare 25 microlitros de la mezcla de PCR en hielo, agregue un microlitro de la plantilla de ADN y establezca las condiciones de ciclo para la amplificación de genes. Después de la PCR, mezcle cinco microlitros de la muestra con un microlitro de colorante de cinco veces la carga de ADN.
Y ejecútelo en un gel de agarosa al 1% para verificar la amplificación. Para el ribosómico 16S, la secuenciación del gen rNA, configure la misma reacción que se describió anteriormente, pero en un volumen mayor. Luego, para purificar los amplicones para la secuenciación de Sanger, mezcle toda la muestra con un tinte de carga de ADN y cárguela en un gel de agarosa para realizar el método de extracción en gel.
Una vez completada la secuenciación, convierta el archivo de resultados a un formato más rápido y compruebe la similitud de la secuencia con la herramienta BLAST en NCBI. Aquí se muestran colonias bacterianas aisladas de muestras de agua de un humedal en Dadri, India. Las bacterias aisladas se cultivaron individualmente en los medios respectivos, con estireno líquido como única fuente de carbono.
El potencial de degradación de hidrocarburos de los aislados bacterianos se evaluó mediante un ensayo de degradación de catecoles. Aquí se muestra un ensayo representativo de uno de los aislados. La integridad del ADN genómico se confirmó visualizando una pequeña muestra de ADN en un gel de agarosa.
Y el gen 16S ribosomal rNA se amplificó utilizando cebadores universales. Se construyó un árbol filogenético para representar la relación entre las cepas de exiguobacterium aisladas de un humedal con las especies de exiguobacterium conocidas. Un paso crítico del protocolo es verificar la utilización del sustrato que se está probando.
Dependiendo de las características de crecimiento, es posible que el microbio no se adapte inmediatamente a la utilización del sustrato que se está probando y que requiera un proceso de enriquecimiento. Este método se centra en la población bacteriana cultivable en muestras ambientales. Los investigadores pueden realizar otros experimentos, como la secuenciación del genoma completo bacteriano y la elaboración de perfiles metabólicos, que pueden proporcionar información valiosa sobre los genes y las vías implicadas en la degradación de los hidrocarburos.
