Este protocolo descreve o isolamento, cultivo e identificação de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos de habitats ecológicos. Este método não requer instrumentos sofisticados e pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório padrão. Também pode ser facilmente adaptado para estudar outros substratos.
Esta técnica pode ser facilmente traduzida para vários nichos ecológicos, e a degradação de diferentes substratos pode ser avaliada. Quem demonstrará o procedimento será Deepa Sethi, doutoranda do laboratório do Dr. Richa Priyadarshini. Para começar, colete 500 mililitros de amostra de água em cinco garrafas de vidro estéreis de diferentes locais do corpo d'água e meça o pH e a temperatura de cada amostra.
Em seguida, filtre a amostra em condições assépticas em lotes de 100 mililitros através de folhas de filtro de tamanho de poro de 0,22 mícron. E coloque as folhas sobre diferentes placas de meio nutriente, colocando um papel por placa. Após duas horas, retire o papel com pinça estéril.
Em seguida, dilua as amostras de água não filtrada adicionando 100 microlitros da amostra de água coletada a 900 microlitros de água destilada dupla estéril. Continuar as diluições de dez vezes até ser atingida uma relação de diluição de um para 1 000 000. Misture por pipetagem e certifique-se de que o volume final de cada diluição é de um mililitro.
Espalhe 100 microlitros das amostras de água diluídas individualmente em todas as placas de meios, em triplicatas. Incubar as placas a 30 graus Celsius por 24 a 48 horas, dependendo do crescimento das colônias. Para obter colônias isoladas, escolha uma colônia usando um palito estéril ou ponta de pipeta.
Realize a estriação do quadrante e incube a placa durante a noite. No dia seguinte, faça uma triagem das colônias com base em suas características morfológicas, como cor, textura, forma, tamanho, margem e elevação. Re-raiar as colônias para obter culturas puras.
Após a coloração de grama de cada cultura pura, preparar os estoques de glicerol inoculando uma única colônia em três mililitros de meio de crescimento apropriado e incubando a 30 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 700 microlitros da cultura noturna e 300 microlitros de 100% de glicerol em frascos de crio. Congele os frascos para injetáveis a menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.
De um prato recém-listrado, pegue uma colônia e inocule-a em cinco mililitros de caldo de soja tríptico ou caldo nutriente. Cultivar a cultura durante a noite a 30 graus Celsius, com agitação a 200 RPM, até que a absorbância atinja aproximadamente dois. No dia seguinte, pellet as células.
Descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com dois mililitros de soro fisiológico autoclavado. Gire as células novamente, depois ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio basal líquido livre de carbono, ou LCFBM, e meça a absorbância. Em seguida, rotular dois frascos Erlenmeyer estéreis de 150 mililitros como A e B, para o grupo controle e experimental, respectivamente.
No frasco A, adicionar 40 mililitros de MCFCCL, seguido de um estireno na concentração final de cinco milimolares. No balão B, adicionar 35 mililitros de LCFBM e estireno. Em seguida, adicione a suspensão celular com uma absorvância final de aproximadamente 0,1.
Após elevar o volume no frasco B para 40 mililitros com LCFBM, incubar ambos os frascos a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por 30 dias. Medir a absorbância de cada frasco a cada cinco dias e traçar uma curva de crescimento. Aumente a incubação em até 45 dias se as bactérias puderem utilizar estireno.
Um aumento na absorbância indica que a bactéria pode metabolizar estireno. Para isolar o DNA genômico de bactérias gram-negativas, escolha uma única colônia e inocular-a em um meio de crescimento fresco em um tubo de ensaio estéril. Após a incubação durante a noite em uma incubadora de agitação, pellet 1,5 mililitros da cultura cultivada.
Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lise. Em seguida, adicione 66 microlitros de solução de cloreto de sódio cinco molares e misture bem. Depois de centrifugar a mistura resultante, pipetar o supinato límpido num tubo de microcentrífuga fresco e adicionar um volume igual de clorofórmio.
Misture a solução invertendo-a várias vezes, até observar uma solução leitosa. Gire o tubo novamente e transfira o sobrenadante para um frasco limpo. Em seguida, adicione um mililitro de etanol 100% gelado e misture por inversão, até que as fitas brancas de DNA se precipitem.
Centrifugar o DNA precipitado. Descarte o sobrenadante. E lave o pellet com um mililitro de etanol 70%.
Após descartar a lavagem, deixe o pellet de DNA secar por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de seco, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão Tris-EDTA. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro e execute o DNA em um gel de agarose a 1% para avaliar sua qualidade.
Para identificar as cepas, amplificar o DNA isolado das culturas bacterianas puras por PCR, com iniciadores universais visando a sequência de RNA ribossomal 16S para bactérias. Prepare 25 microlitros da mistura de PCR no gelo, adicione um microlitro do molde de DNA e defina as condições de ciclagem para amplificação gênica. Após a PCR, misturar cinco microlitros da amostra com um microlitro de cinco vezes o corante de carga de DNA.
E execute-o em um gel de agarose a 1% para verificar a amplificação. Para o 16S ribossomal, o sequenciamento do gene rNA configura a mesma reação descrita anteriormente, porém em maior volume. Em seguida, para purificar os amplicons para o sequenciamento de Sanger, misture toda a amostra com corante de carregamento de DNA e carregue-a em um gel de agarose para realizar o método de extração em gel.
Uma vez que o sequenciamento esteja concluído, converta o arquivo de resultados em um formato mais rápido e verifique a similaridade da sequência usando a ferramenta BLAST no NCBI. Colônias bacterianas isoladas de amostras de água de uma área úmida em Dadri, Índia, são mostradas aqui. As bactérias isoladas foram cultivadas individualmente nos respectivos meios, tendo como única fonte de carbono estireno líquido.
O potencial degradador de hidrocarbonetos dos isolados bacterianos foi avaliado usando um ensaio de degradação de catecol. Um ensaio representativo para um dos isolados é mostrado aqui. A integridade do DNA genômico foi confirmada pela visualização de uma pequena amostra de DNA em gel de agarose.
E o gene rNA ribossomal 16S foi amplificado usando primers universais. Uma árvore filogenética foi construída para descrever a relação entre cepas de exiguobacterium isoladas de uma área úmida com as espécies de exiguobacterium conhecidas. Uma etapa crítica do protocolo é verificar a utilização do substrato a ser testado.
Dependendo das características de crescimento, o micróbio pode não se adaptar imediatamente à utilização do substrato a ser testado, e pode exigir um processo de enriquecimento. Este método enfoca a população bacteriana cultivável em amostras ambientais. Os pesquisadores podem ainda realizar experimentos, como o sequenciamento do genoma inteiro bacteriano e o perfil metabólico, que podem fornecer informações valiosas sobre genes e caminhos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos.
