Questo protocollo delinea l'isolamento, la coltivazione e l'identificazione di microrganismi che degradano gli idrocarburi dagli habitat ecologici. Questo metodo non richiede strumenti sofisticati e può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio standard. Può anche essere facilmente adattato per studiare altri substrati.
Questa tecnica può essere facilmente tradotta in varie nicchie ecologiche e può essere valutata la degradazione di diversi substrati. A dimostrare la procedura sarà Deepa Sethi, una dottoranda del laboratorio della dottoressa Richa Priyadarshini. Per iniziare, raccogliere 500 millilitri di campione d'acqua in cinque bottiglie di vetro sterili da diversi siti di corpi idrici e misurare il pH e la temperatura di ciascun campione.
Quindi filtrare il campione in condizioni asettiche in lotti da 100 millilitri attraverso fogli filtranti di dimensioni dei pori da 0,22 micron. E posizionare i fogli su diverse piastre di supporti nutritivi, posizionando una carta per piatto. Dopo due ore, staccare la carta usando una pinza sterile.
Quindi, diluire i campioni di acqua non filtrata aggiungendo 100 microlitri del campione d'acqua raccolto a 900 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione. Continuare le diluizioni di dieci volte fino a raggiungere un rapporto di diluizione da uno a 1.000.000. Miscelare mediante pipettaggio e assicurarsi che il volume finale di ciascuna diluizione sia di un millilitro.
Distribuire singolarmente 100 microlitri di campioni di acqua diluita su tutte le piastre dei terreni di crescita, in triplice copia. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24-48 ore, a seconda della crescita delle colonie. Per ottenere colonie isolate, scegli una colonia usando uno stuzzicadenti sterile o una punta per pipetta.
Eseguire la striatura del quadrante e incubare la piastra durante la notte. Il giorno successivo, esamina le colonie in base alle loro caratteristiche morfologiche, come colore, consistenza, forma, dimensione, margine ed elevazione. Ri-striscia le colonie per ottenere colture pure.
Dopo aver eseguito la colorazione di grammo di ogni coltura pura, preparare le scorte di glicerolo inoculando una singola colonia in tre millilitri di terreno di coltura appropriato e incubando a 30 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere 700 microlitri di coltura durante la notte e 300 microlitri di glicerolo al 100% in fiale criogeniche. Congelare i flaconcini a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
Da un piatto appena striato, scegli una colonia e inoculala in cinque millilitri di brodo di soia trittico o brodo nutriente. Coltivare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius, con agitazione a 200 RPM, fino a quando l'assorbanza raggiunge circa due. Il giorno dopo, pellet le cellule.
Scartare il surnatante e lavare il pellet due volte con due millilitri di soluzione salina in autoclave. Ruotare nuovamente le cellule, quindi risospendere il pellet in due millilitri di mezzo basale liquido privo di carbonio, o LCFBM, e misurare l'assorbanza. Quindi, etichettare due palloni Erlenmeyer sterili da 150 millilitri come A e B, rispettivamente per il gruppo di controllo e per il gruppo sperimentale.
Nel matraccio A, aggiungere 40 millilitri di LCFBM, seguito da uno stirene ad una concentrazione finale di cinque millimolari. Nel pallone B, aggiungere 35 millilitri di LCFBM e stirene. Quindi aggiungere la sospensione cellulare con un'assorbanza finale di circa 0,1.
Dopo aver portato il volume in matraccio B a 40 millilitri con LCFBM, incubare entrambi i matraccio a 30 gradi Celsius agitando a 200 RPM per 30 giorni. Misurare l'assorbanza di ciascun pallone ogni cinque giorni e tracciare una curva di crescita. Aumentare l'incubazione fino a 45 giorni se i batteri possono utilizzare lo stirene.
Un aumento dell'assorbanza indica che il batterio può metabolizzare lo stirene. Per isolare il DNA genomico dai batteri gram-negativi, scegliere una singola colonia e inocularla in un nuovo mezzo di crescita in una provetta sterile. Dopo l'incubazione durante la notte in un incubatore agitatore, pellet 1,5 millilitri della coltura coltivata.
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lisi. Quindi aggiungere 66 microlitri di soluzione di cloruro di sodio a cinque molari e mescolare bene. Dopo aver centrifugato la miscela risultante, pipettare il supinato trasparente in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere un volume uguale di cloroformio.
Mescolare la soluzione capovolgendola più volte, fino a quando non si osserva una soluzione lattiginosa. Ruotare nuovamente il tubo e trasferire il surnatante in una fiala pulita. Quindi, aggiungere un millilitro di etanolo ghiacciato al 100% e mescolare per inversione, fino a quando i filamenti bianchi di DNA precipitano.
Centrifugare il DNA precipitato. Scartare il surnatante. E lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70%.
Dopo aver eliminato il lavaggio, lasciare asciugare il pellet di DNA per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta essiccato, risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro ed eseguire il DNA su un gel di agarosio all'1% per valutarne la qualità.
Per identificare i ceppi, amplificare il DNA isolato dalle colture batteriche pure mediante PCR, con primer universali mirati alla sequenza di RNA ribosomiale 16S per i batteri. Preparare 25 microlitri della miscela PCR su ghiaccio, aggiungere un microlitro del modello di DNA e impostare le condizioni cicliche per l'amplificazione genica. Dopo la PCR, mescolare cinque microlitri del campione con un microlitro di colorante di carico del DNA cinque volte.
Ed eseguirlo su un gel di agarosio all'1% per verificare l'amplificazione. Per il 16S ribosomiale, il sequenziamento del gene rNA, imposta la stessa reazione descritta in precedenza, ma in un volume più alto. Quindi, per purificare gli ampliconi per il sequenziamento Sanger, mescolare l'intero campione con colorante di caricamento del DNA e caricarlo su un gel di agarosio per eseguire il metodo di estrazione del gel.
Una volta completata la sequenziazione, converti il file dei risultati in un formato più veloce e controlla la somiglianza della sequenza utilizzando lo strumento BLAST su NCBI. Le colonie batteriche isolate da campioni d'acqua provenienti da una zona umida a Dadri, in India, sono mostrate qui. I batteri isolati sono stati coltivati individualmente nei rispettivi mezzi, con stirene liquido come unica fonte di carbonio.
Il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici è stato valutato utilizzando un test di degradazione del catecolo. Un saggio rappresentativo per uno degli isolati è mostrato qui. L'integrità del DNA genomico è stata confermata visualizzando un piccolo campione di DNA su un gel di agarosio.
E il gene rNA ribosomiale 16S è stato amplificato usando primer universali. Un albero filogenetico è stato costruito per rappresentare la parentela tra i ceppi di exiguobacterium isolati da una zona umida, con la nota specie di exiguobacterium. Un passo critico del protocollo è quello di verificare l'utilizzo del substrato da testare.
A seconda delle caratteristiche di crescita, il microbo potrebbe non adattarsi immediatamente all'utilizzo del substrato testato e potrebbe richiedere un processo di arricchimento. Questo metodo si concentra sulla popolazione batterica coltivabile nei campioni ambientali. I ricercatori possono inoltre eseguire esperimenti, come il sequenziamento dell'intero genoma batterico e la profilazione metabolica, che possono fornire preziose informazioni sui geni e sui percorsi coinvolti nella degradazione degli idrocarburi.
